Мониторинг убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с помощью Degron (DGN)-дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (GFP)-Reporter на основе белков
Summary
Метод мониторинга убиквитин-протеасомной активности в живых клетках описано. Degron-дестабилизированный GFP-(GFP-DGN) и стабильный GFP-dgnFS гибридного белка создаются и преобразованных в ячейку с помощью лентивирусов вектор экспрессии. Этот метод позволяет генерировать стабильный GFP-dgn/GFP-dgnFS выражения клеточная линия, в которой убиквитин-протеасомной активности может быть легко оценить, используя эпифлуоресцентной или проточной цитометрии.
Abstract
Протеасомы является основным внутриклеточным органелл, участвующих в протеолитической деградации ненормально, неправильно свернутых, повреждены или окисленных белков 1, 2. Поддержание активности протеасом был замешан во многих ключевых клеточных процессов, таких как стресс клетки ответ 3, регуляцию клеточного цикла и клеточной дифференцировки 4 или в ответ иммунной системы 5. Дисфункции убиквитин-протеасомной системы была связана с развитием опухолей и нейродегенеративных заболеваний, 4, 6. Кроме того, снижение активности протеасом был найден как функция клеточного старения и старения организмов 7, 8, 9, 10. Здесь мы представляем метод измерения убиквитин-протеасомной активности в живых клетках с использованием GFP-DGN гибридного белка. Чтобы быть в состоянии контролировать убиквитин-протеасомной активности в живых первичных элементов, комплементарной ДНК строит кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP)-DGN гибридного белка (GFP-DGN, неустойчивые) и вариант проведения рамки мутации (GFP-dgnFS, стабильные 11), которые вставляются в лентивирусов векторов экспрессии. Мы предпочитаем этот метод по сравнению с традиционными методами трансфекции, потому что она гарантирует очень высокую эффективность трансфекции зависит от типа клеток или возраст донора. Разница между флуоресценцией отображается GFP-dgnFS (стабильный) белка и дестабилизировали белка (GFP-DGN) в отсутствие или в присутствии ингибитора протеасом может быть использован для оценки убиквитин-протеасомной активности в каждый конкретный штамм клеток. Эти различия можно контролировать с помощью эпифлуоресцентной микроскопии или может быть измерена с помощью проточной цитометрии.
Protocol
Discussion
Первые публикации с помощью зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве репортера субстрат для убиквитин-протеасомной деятельность была опубликована в 2000 12. С тех пор, GFP стал распространенным инструментом для визуализации клеточной активности, особенно убиквитин-протеасомн?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано: Национальная сеть исследований по проблемам старения (NFN S93) по австрийским научного фонда (БПС), Европейская комиссия Интегрированные проекты MiMAGE и PROTEOMAGE, Нидерланды Genomics Инициатива / Нидерландская организация по научным исследованиям (NGI / NWO; 05040202 и 050 – 060-810 NCHA), финансируемого ЕС Сети мастерства продолжительность жизни (FP6 036 894), инновациям и ориентированных программ исследований геномики (SenterNovem; IGE01014 и IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
Riferimenti
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
