Сфероид Пробирной для измерения TGF-β-индуцированной Вторжение
Summary
Анализа количественно измерить трансформирующий фактор роста (TGF)-β-индуцированной вторжения в 3-мерном гели коллагена описано. Этот тест использует преимущества серии MCF10A клеточных линий, которые представляют различные стадии развития рака молочной железы. Этот метод может быть принята для использования с другими клеточными линиями и может быть использован для исследования других возможных активаторов или ингибиторов вторжения.
Abstract
TGF-β имеет противоположные роли в груди прогрессии рака, действуя как супрессоры опухолевого роста на начальном этапе, но стимулирующие инвазии и метастазирования на более поздней стадии 1,2. Более того, TGF-β, часто избыточно экспрессируется при раке молочной железы, и его экспрессия коррелирует с плохим прогнозом и метастазирования 3,4. Механизмов, посредством которых TGF-β вызывает вторжение не до конца понятны.
TGF-β вызывает ее клеточный ответ через TGF-β типа II (TβRII) и типа I (TβRI) рецепторы. По TGF-β-индуцированной heteromeric сложное образование, TβRII фосфорилирует TβRI. Активированный TβRI инициирует его внутриклеточной канонической сигнальный путь от фосфорилирования рецептора Smads (R-Smads), т.е. Smad2 и Smad3. Эти активированные R-Smads форме heteromeric комплексов с Smad4, которые накапливаются в ядре и регулируют транскрипцию генов-мишеней 5. В дополнение к ранее гвневписанной Smad пути, активация рецептора приводит к активации ряда других не Smad сигнальных путей, например Митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути 6.
Для изучения роли TGF-β в различных стадиях рака молочной железы, мы использовали системы клетки MCF10A. Эта система состоит из спонтанно увековечены MCF10A1 (M1) груди эпителиальных клеток 7, H-RAS преобразован М1-производных MCF10AneoT (M2), которая производит предраковых поражений у мышей, 8, и М2-производная MCF10CA1a (М4), которая была создана с М2 ксенотрансплантаты и форм высококачественного карциномы со способностью к метастазированию в легкие 9. Это MCF10A серия предлагает возможность изучать ответы клеток с различной степенью злокачественности, которые не искаженных различных генетических фоне.
Для анализа TGF-β-индуцированной вторжения, мы сгенерировали однотипных MCF10A сфероида клеточных культур embedded в 3D-матрицу коллагена в пробирке (рис. 1). Такие модели очень напоминают человеческих опухолей в естественных условиях путем создания градиента кислорода и питательных веществ, в результате активной и инвазивных клеток на улицу и покоя и даже некротических клеток внутри сфероида 10. Сфероид основаны анализы также показали, чтобы лучше резюмировать лекарственной устойчивостью, чем монослой культур 11. Это MCF10 3D модель системы позволяет исследовать воздействие TGF-β сигнализации на инвазивные свойства грудного клетки на различных стадиях злокачественных новообразований.
Protocol
Discussion
Мы создали сфероида модель, в которой MCF10A1 клетки и ее производных злокачественных вторгнуться в коллагеновой матрице в TGF-β-зависимым образом. Во-первых, сфероидов образуются в 96-скважин круглым дном подвеской плит в присутствии метилцеллюлозы. Конечно, также П-образные поли-НЕМА покр?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Кен Ивата (OSI Pharmaceuticals, Нью-Йорк, США) для реагентов и Фред Миллер (Barbara Ann Karmanos Рак Intitute, Детройт, США) для клеточных линий.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
References
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer–a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
