كروي الفحص لقياس TGF - β بفعل الغزو
Summary
يوصف لفحص لقياس كميا تحويل عامل النمو (TGF) – β بفعل الغزو في المواد الهلامية الكولاجين 3 الأبعاد. هذا الاختبار يستفيد من سلسلة MCF10A من خطوط الخلايا التي تمثل مراحل مختلفة من تطور مرض السرطان الثدي. ويمكن اعتماد هذه الطريقة ليتم استخدامها مع خطوط الخلايا الأخرى ، ويمكن استخدامها لتفعيل التحقيق المحتملين الآخرين أو مثبطات الغزو.
Abstract
TGF – β ومعارضة الأدوار في تطور سرطان الثدي عن طريق العمل كمركز الكابتة للورم في المرحلة الأولي ، ولكن تحفيز الغزو والانبثاث في 1،2 مرحلة لاحقة. علاوة على ذلك ، كثيرا ما هى overexpressed TGF – β في سرطان الثدي وتعبيرها يرتبط بسوء التشخيص والانبثاث 3،4. الآليات التي لا TGF – β يدفع الغزو مفهومة جيدا.
TGF – β يتسبب ردوده الخلوية عبر النوع الثاني TGF – β (TβRII) والنوع الأول (TβRI) المستقبلات. عند تشكيل TGF – β المعقدة التي يسببها مغايرة التغصن ، TβRII phosphorylates في TβRI. وTβRI تنشيط يبدأ في الخلايا مما يشير المسار الكنسي Smads بواسطة مستقبلات phosphorylating (R – Smads) ، أي Smad2 وSmad3. تنشيط هذه R – Smads شكل مجمعات مغايرة التغصن مع Smad4 والتي تتراكم في نواة وتنظيم النسخ للجينات الهدف 5. بالإضافة إلى د سابقامسار Smad escribed ، والنتائج في تنشيط مستقبلات تفعيل عدة مسارات أخرى غير Smad يشير ، على سبيل المثال Mitogen المنشط بروتين كيناز (MAPK) 6 مسارات.
لدراسة دور β – TGF في مراحل مختلفة من سرطان الثدي ، والتي قطعناها على أنفسنا استخدام نظام MCF10A الخلية. حولت H – RAS هذا النظام يتألف من خلايا خلدت عفويا MCF10A1 الثدي (M1) الظهارية 7 ، M1 – المشتقة MCF10AneoT (M2) ، والتي تنتج آفات مرحلة ما قبل 8 في الفئران ، وMCF10CA1a M2 المشتقة (M4) ، الذي أنشئ من M2 xenografts وأشكال سرطان الدرجة العالية ، مع القدرة على metastasize إلى 9 في الرئة. هذه السلسلة MCF10A توفر إمكانية لدراسة استجابات الخلايا مع درجات مختلفة من الأورام الخبيثة التي ليست منحازة بواسطة خلفية وراثية مختلفة.
لتحليل TGF – β بفعل الغزو ، ولدت لنا MCF10A كروي مثلي النمط embe الثقافات الخليةdded في مصفوفة 3D الكولاجين في المختبر (الشكل 1). مثل هذه النماذج البشرية تشبه الأورام في الجسم الحي من خلال إنشاء التدرج من الاوكسجين والمواد الغذائية ، مما أدى إلى خلايا نشطة والغازية على الخلايا خارج وهادئة أو حتى نخرية في الداخل من 10 كروي. كما تم عرض كروي المقايسات تستند إلى أفضل تلخيص مقاومة المخدرات من الثقافات أحادي الطبقة 11. يسمح هذا النموذج 3D MCF10 نظام لنا لتحقيق تأثير TGF – β يدل على خصائص الغازية من خلايا الثدي في مراحل مختلفة من السرطان.
Protocol
Discussion
أنشأنا نموذجا كروي التي MCF10A1 الخلايا الخبيثة ومشتقاته في غزو مصفوفة الكولاجين بطريقة TGF – β – تعتمد. أولا ، يتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية في 96 بئرا لوحات تعليق الجولة القاع في وجود methylcellulose. بالطبع ، يمكن أن تستخدم أيضا على شكل حرف U بولي HEMA لوحات مغلفة لهذا الغرض. مطلو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لايواتا كين (OSI الصيدلة ، نيويورك ، الولايات المتحدة) عن الكواشف وفريد ميلر (باربرا آن كارمانوس للسرطان Intitute ، ديترويت ، الولايات المتحدة الأمريكية) لخطوط الخلية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PureCol | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| pH indicator strips | Merck | 9533 | |
| 96-well suspension plates |
Greiner Bio-one | 650 185 | |
| 96-well adhesion TC plates |
Greiner Bio-one | 655 180 |
References
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer–a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
- Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
- ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
- Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
- Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
- Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
- Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn’t flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
- Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
- Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
- Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
- Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
- Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
- Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
- Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
- Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).
