Un simple et générale méthode manuelle synthèse peptoïde impliquant l'équipement de base et de réactifs disponibles dans le commerce est présenté, permettant peptoïdes pour être facilement synthétisée dans la plupart des laboratoires. La synthèse, la purification et la caractérisation d'une 36mer peptoïde amphiphile est décrite, ainsi que son auto-assemblage en très ordonnée nanofeuillets.
Peptoïdes sont une nouvelle classe de biomimétiques, non naturelles, des séquences spécifiques qui résistent à la protéolyse hétéropolymères, présentent une puissante activité biologique, et incorporer des nanostructures d'ordre supérieur. Structurellement similaires aux peptides, peptoïdes sont des poly N-substitué glycines, où les chaînes latérales sont attachés à l'azote plutôt que l'alpha-carbone. Leur facilité de synthèse et de la diversité structurelle permet de tester des principes de conception de base pour conduire de novo design et l'ingénierie de nouveaux matériaux biologiquement actifs et nanostructurés.
Ici, un protocole simple manuel peptoïde synthèse est présentée qui permet la synthèse de la longue chaîne polypeptoids (jusqu'à 50mers) avec d'excellents rendements. Seuls les équipements de base, des techniques simples (par exemple le transfert de liquide, filtration), et des réactifs disponibles dans le commerce sont tenus, faisant un ajout peptoïdes accessible à outils de nombreux chercheurs. L'épine dorsale peptoïde est cultivé un monomère à un temps de vIA la méthode submonomer qui consiste en une à deux étapes du cycle d'addition du monomère: acylation et de déplacement. Tout d'abord, l'acide bromoacétique activé di situ avec le N, N'-diisopropylcarbodiimide acylates une résine assortis amine secondaire. Deuxièmement, le déplacement nucléophile du bromure par une amine primaire suit pour introduire la chaîne latérale. Le cycle à deux étapes est itérée jusqu'à ce que la longueur de la chaîne désirée est atteinte. L'efficacité du couplage de ce cycle en deux étapes dépasse régulièrement 98% et permet la synthèse de peptoïdes aussi longtemps que 50 résidus. Très configurable, précis et chimiquement séquences diverses sont réalisables avec la méthode submonomer que des centaines de disponibles amines primaires peuvent être directement intégrées.
Peptoïdes sont en train de devenir un matériau polyvalent biomimétiques pour la recherche Nanobioscience en raison de leur flexibilité, la robustesse de synthèse, et ordonnant à l'échelle atomique. Le repliement d'une chaîne unique, amphiphiles, de l'informationtion riche en polypeptoid dans un nanosheet hautement ordonné a été récemment démontré. Cette peptoïde est un 36-mer qui se compose de seulement trois différents monomères disponibles dans le commerce: hydrophobe, cationiques et anioniques. Les chaînes hydrophobes latérales phényléthyle sont enterrés dans le cœur nanosheet alors l'amine ioniques et des chaînes latérales carboxyle s'aligner sur les visages hydrophile. Le nanofeuillets peptoïde servir de plateforme pour les potentiels de membrane mimétiques, mimétiques de protéines, fabrication de dispositifs, et des capteurs. Méthodes de synthèse peptoïde, formation de la feuille, et l'imagerie par microscopie sont décrites et fournir une méthode simple pour permettre aux futurs designs nanosheet peptoïde.
Applications et importance
Ce protocole décrit une méthode simple et efficace de synthèse peptoïde et la phase aqueuse auto-assemblage de l'peptoïdes en nanofeuillets. La plupart des laboratoires sont facilement capables de synthétiser des matériaux peu coûteux, car peptoïdes, d'expertise et techniques de base simples sont utilisés 4. De même, l'auto-assemblage de l'ultra-mince, très ordonnée nanofeuillets nécessite simplement répété inclinant un flacon d'une solution aqueuse diluée peptoïde 2. Peptoïdes sont prometteurs des matériaux pour la recherche biomédicale et de la nanoscience, car ils sont robustes et flexibles mais synthétiquement séquence-spécifique et hautement accordables 5. Peptoïdes ont démontré une activité biologique (6,7 thérapeutiques, diagnostiques 8, délivrance intracellulaire 9-10) et le pliage en nanostructures hiérarchique 3, 11-14. En raison de leur synthèse modulaire, combinatoire peptoïde librArles 15-19 peuvent être facilement synthétisés et tamisés pour une série d'activités ou propriétés. En particulier, le nanofeuillets servir de plate-forme potentielle pour les échafaudages d'affichage en deux dimensions, mimétiques membrane, capteurs biologiques, protéines et mimétiques fabrication du dispositif. Avec les séquences pratiquement inépuisable différents possible, le domaine de la recherche peptoïde s'étend rapidement.
Variables dans la synthèse en phase solide submonomer des polypeptoids
En raison de la possibilité de choisir parmi un alphabet incroyablement vaste et diversifié de monomères 20, la méthode submonomer besoins modifications occasionnelles pour les cas où l'augmentation de l'efficacité du couplage de chaque étape sera d'améliorer le rendement global du produit. Incorporation de chaînes latérales non protégées hétérocycliques nécessite l'utilisation de l'acide chloracétique lieu de l'acide bromoacétique 21. Fois le déplacement prolongé et plusLes concentrations d'amine sont généralement employés après environ 20 raccords pour de longues séquences peptoïde ou amines moins nucléophiles. Le chauffage de la cuve de réaction à 35 ° C, en utilisant un réacteur à chemise d'eau, aide à conduire la réaction. Pour hautement volatile amines telles que l'isopropylamine, des précautions doivent être prises pour éviter l'évaporation.
Amines sous la forme d'un sel HCl, tels que des t-butyl-bêta-alanine HCl, doivent être libres à base avant d'être introduit dans la réaction de déplacement. Ceci peut être réalisé par dissolution ou suspension de l'amine dans le DCM (~ 5g amine/25 ml de DCM), et de neutralisation avec une solution équimolaire d'hydroxyde de sodium aqueux dans une ampoule à décanter. La couche de DCM est recueilli et la couche aqueuse est lavée avec du DCM supplémentaire. Les couches DCM combinées sont séchées sur sulfate de sodium et filtrée dans un ballon à fond rond pré-pesées. Éliminer le solvant par évaporation rotative pour donner une huile, et noter le poids du produit.
During l'étape de clivage, cocktail clivage TFA et le temps de clivage est dépendant du nombre et la variété de groupes de protection utilisés. Directives pour les cocktails de clivage sont similaires à des clivages traditionnels déprotection peptide 1. Généralement, 10 incubations minute sont nécessaires pour des séquences sans la protection des groupes ou des séquences avec quelques très acides labiles groupes de protection (par exemple BOC, trityle). Deux heures d'incubation sont recommandées pour des séquences plus difficiles groupes de protection (par exemple t-butyle, Mtr, PBF) ou des séquences avec de nombreux groupes de protection pour assurer une déprotection totale de chaque chaîne. Brut produits peptoïde sera généralement se dissoudre dans l'acétonitrile: eau 1:1 (v / v), mais les proportions d'acétonitrile supérieur sont communs avec des chaînes latérales avec une hydrophobicité globale élevée.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Byoung-Chul Lee, Philip Choi et Samuel Ho pour une aide précieuse. Ce travail a été réalisée à la Fonderie Moléculaire au Lawrence Berkeley National Laboratory, qui est soutenu par le Bureau de la science, Bureau des sciences fondamentales de l'énergie, du Département américain de l'Énergie en vertu du contrat n ° DE-AC02-05CH11231 et la réduction de la menace de la Défense Agence sous le n ° du contrat: IACRO-B0845281.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Dimethylformamide | EMD | EM-DX1726P-1 | 99+% |
N-methylpyrrolidinone | BDH | BDH1141-4LP | 99% |
Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
4-Methylpiperidine | Sigma Aldrich | M73206 | 96% |
N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex | 001100 | 99.5% |
Dichloromethane | EMD | EMD-DX0835 | ACS grade |
Acetonitrile | EMD | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | 99% |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
1,2-Dichloroethane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
Phenethylamine | Sigma Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
Nile Red | Sigma Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
Dichlorodimethylsilane | Sigma Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
Disposable 3 way luer adapter | Cole Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
Luer Lock ring | Cole Parmer | 45503-19 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Fittings Luer | Cole Parmer | 45500-20 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
Disposable PP pipets | VWR | 16001-194 | For TFA transfers |
Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
1 dram glass vial | VWR | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
20 mL scintillation vial | VWR | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
Cover slip | VWR | 48366-067 | For fluorescence imaging |
4” Silicon wafer | Ted Pella | 16007 | Pre-dice in 5×7 mm chips |
0.45 filter | VWR, Acrodisc | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
Agarose | BD | 212272 | For fluorescence imaging |
SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Plasma | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |