Summary
C57BL में GL261 कोशिकाओं / 6 चूहों intracranial आरोपण घातक gliomas है कि मानव glioblastoma मल्टीफार्मी की पहचान के कई पुनरावृत्ति करना पैदा करता है. हम GL261 stably luciferase व्यक्त कोशिकाओं का इस्तेमाल करने के लिए हमें का उपयोग करने के लिए की अनुमति
Protocol
1. सेल संस्कृति
- GL26 सेल लाइन कैंसर के उपचार और निदान (DCTD) राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (NCI), फ्रेडरिक, एमडी की डिवीजन से प्राप्त हुई थी. ट्यूमर के विकास दर GL261 कोशिकाओं का एक मात्रात्मक माप की सुविधा के लिए बनाया गया bioluminescent Lentiphos एचटी प्रणाली (Clontech प्रयोगशालाओं, Inc, माउंटेन व्यू, सीए) के साथ Lenti एक्स हिंदुस्तान टाइम्स पैकेजिंग (Clontech प्रयोगशालाओं, Inc) मिक्स और FUW का उपयोग जीएल प्लाज्मिड (जेबी रुबिन, एमडी, पीएचडी की प्रयोगशाला से एक उदार उपहार). कक्ष Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 10% टेट्रासाइक्लिन मुक्त भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS; Clontech प्रयोगशालाओं इंक) के साथ बनाए रखा गया. GL261 कोशिकाओं को भी stably थे जीन एन्कोडिंग pGL4.51 [luc2 / सीएमवी / नव] (Promega कॉर्प, मैडिसन, WI) वेक्टर और FuGENE 6 अभिकर्मक अभिकर्मक (Roche एप्लाइड साइंस, इंडियानापोलिस में) का उपयोग luc2 के साथ निम्न द्वारा निर्दिष्ट शर्तों ट्रांसफ़ेक्ट निर्माता. luc2 जीन जुगनू lucifera के एक अनुकूलित संस्करण codonसे है कि एक मानक ल्यूक जीन की तुलना में काफी अधिक प्रकाश उत्पादन प्रदान करता है. स्थिर transfectants चयनित और DMEM मीडिया युक्त 10% FCS और 100 μg / एमएल Geneticin (G418, Invitrogen कार्पोरेशन, Carlsbad, CA) में रखा गया.
- पहले आरोपण के लिए संवर्धित कोशिकाओं trypsinzation द्वारा harvested रहे हैं, सीरम के बिना DMEM में एक बार धोया और सीरम के बिना DMEM में 1 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में resuspended.
2. सर्जरी 2 सेटअप
- एक बाँझ वातावरण सर्जरी भर में बनाए रखा है, सभी शल्य चिकित्सा उपकरण, आपूर्ति, दस्ताने, पर्दे, आदि सहित,.
- दस सप्ताह पुरानी (सूरजमुखी मनुष्य C57BL / 6) C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr चूहों फ्रेडरिक पशु उत्पादन कार्यक्रम में राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से खरीद रहे हैं और 20 ग्राम के एक औसत वजन (NCI, फ्रेडरिक, एमडी) में इस्तेमाल किया.
- पशु xylazine (5 मिग्रा / किग्रा), (50 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine और buprenorphine (0.05 मिलीग्राम / किग्रा) के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा anesthetized हैं. सेई चुटकी करने के लिए सुनिश्चित करें कि जानवर पर्याप्त रूप से है anesthetized से पहले सर्जरी शुरू कर दिया है किया है. जानवर के किसी भी हिस्से की मूवमेंट (भले ही मामूली) संज्ञाहरण के स्तर में कमी का एक संकेत है. पशु तुरंत एक अतिरिक्त 3.3 xylazine मिलीग्राम / किग्रा और 26.6 मिलीग्राम / किग्रा ketamine दिया है. शरीर का तापमान एक दीपक और शरीर को कवर बाँझ ड्रेसिंग का उपयोग करने के लिए बनाए रखा है.
- एक बार ठीक anesthetized जानवर है, वे stereotactic headframe के तकिये बिस्तर (मॉडल 900 छोटे पशु Stereotaxic, डेविड Kopf उपकरण) [चित्रा 1] पर रखा जाता है.
- Akwa आँसू नेत्र स्नेहक मरहम की एक छोटी राशि (1 / 4 इंच) corneas पर लागू होता है.
- जानवर stereotactic फ्रेम में पशु के मुंह (जानवर जबड़े के चारों ओर अपने सूचकांक उंगली और अंगूठे रखकर) खोलने और stereotactic फ्रेम में खरोज में शीर्ष सामने दांत फिसलने द्वारा सुरक्षित है. क्लैंप करने के लिए हेडसेट में जानवर के सिर को सुरक्षित करने के लिए कड़ा है यकीन है कि वेंई सिर गठबंधन है और आँखें केंद्रित कर रहे हैं, यकीन है कि लेकिन जानवर के सिर पर अनुचित बल नहीं लागू करने के लिए बना.
- हे 2 नली नीचे जानवरों की नाक के पास टेप है. ऑक्सीजन प्रवाह दर 0.5 एल / मिनट है.
- पीठ के निचले हिस्से और पूंछ नीचे stereotactic सावधान किया जा रहा है के लिए respirations समझौता नहीं बिस्तर पर टेप है.
- शल्य चीरा साइट मुंडा है. Povidine-आयोडीन झाड़ू से साफ़ करना छड़ें करने के लिए आयोडीन के साथ कान के बीच क्षेत्र के लिए वापस जा रहा आंखों के बीच क्षेत्र धोने, सुनिश्चित करें कि आयोडीन जानवर की आँखों में ड्रिप नहीं करता है करने के लिए उपयोग किया जाता है.
- कोशिकाओं आरोपण के लिए तैयार कर रहे हैं सिर्फ सर्जरी से पहले कर रहे हैं और समय - समय पर वे समझौता नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए मिश्रित.
- एक 10 μl, 50 मिमी विश्व प्रेसिजन (डब्ल्यूपीआई) साधन, Sarasota, FL, 26 गेज beveled सुई के साथ सिरिंज सेल inoculum के साथ भरी हुई है. यदि कोशिकाओं को साथ clumped लग रहे हो यह सिरिंज पुनः लोड करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- 10 μl सिरिंज तो Ultram UMP3-1 के में रखा गया हैicroPump सूक्ष्म सुई लगानेवाला (डब्ल्यूपीआई, Sarasota, FL).
3. Intracranial आरोपण 2
- त्वचा चीरा एक आकार 15 स्केलपेल ब्लेड और दांतेदार संदंश का उपयोग किया है. एक 10-15 मिमी का चीरा longitudinally जानवर की आंखों के बीच से किया जाता है, जानवर कान उजागर ब्रैग्मा (बाण के समान और खोपड़ी के शीर्ष पर राज्याभिषेक sutures के जंक्शन) की ओर बढ़. ठीक ब्रैग्मा पहचान के लिए यह आसानी से साइनस क्षेत्र है जो ब्रैग्मा [चित्रा 2] के लिए बाहर का है के साथ भ्रमित किया जा सकता है है यकीन है.
- जानवर बेहोश होने के बाद यह अंतर incisional 0.25% (2.5 मिलीग्राम / एमएल) bupivacaine का एक इंजेक्शन प्राप्त करता है.
- एक burrhole धीरे धीरे एक 16 1 हाथ से आधा इंच गेज सुई घुमा, सुई से थोड़ा दबाव लागू करते समय घुमा जब तक खोपड़ी और penetrated है मस्तिष्क अवगत कराया है द्वारा 0.1 ब्रैग्मा के लिए पीछे मिमी और 2.3 मिमी midline के अधिकार के लिए किया जाता है.
- सिरिंज सुई नीचे की स्थिति में ले जाया जाता है Microdrive Ste के प्रयोगreotactic सिरिंज धारक जब तक यह सिर्फ मस्तिष्क की सतह से छू. इस स्थिति से, सुई मस्तिष्क में 3 मिमी की गहराई के लिए उन्नत है और 3 मिनट के लिए जगह में रखा.
- सुई मस्तिष्क की सतह से नीचे 2.6 मिमी की कुल गहराई 0.4 मिमी वापस ले लिया है, जहां कोशिकाओं को संचार हो जाता है एक छोटी सी जेब बनाने. यह इस बात पर जानवर में सुई एक्स - रे की एक छवि लेने के लिए उचित स्थान और गहराई को सुनिश्चित करने के लिए वैकल्पिक है.
- सेल निलंबन 3 मिनट सूक्ष्म सुई लगानेवाला का उपयोग कर 667 nl / मिनट की एक जलसेक दर के साथ 2000 NL (2 μL) के एक मात्रा के लिए सेट पर संचार होता है.
- सुई 2 मिनट जलसेक की साइट से रिसाव को रोकने के के लिए जगह में छोड़ दिया है.
- सुई धीरे - धीरे पूरी तरह से वापस ले लिया है.
- burrhole हड्डी Penfield चीड़फाड़ करनेवाला का उपयोग मोम के साथ भरा है.
- चीरा 4-0 (1.5 मीट्रिक) vicryl यकीन है कि कोई बड़े अंतराल त्वचा में छोड़ दिया जाता है बनाने सीवन का उपयोग sutured है. Vicryl सिवनी सामग्री है कि भंगहै, और इसलिए sutures जब चीरा चंगा है हटाया जा जरूरत नहीं है.
- सर्जरी के बाद जानवरों को एक पिंजरे में एक हीटिंग दीपक आवश्यक ऊंचाई पर सेट कर दिया जाता है 30 से पिंजरे के नीचे सतह गर्म डिग्री सेल्सियस के तहत रखा जाता है जब जानवरों पूरी तरह से जाग रहे हैं (के रूप में पिंजरे में सामान्य आंदोलन से न्याय) वे ग्रुप हाउसिंग के लिए लौट रहे हैं. मौखिक ibuprofen के बाद operatively 5 दिनों के लिए उनके पीने के पानी के लिए जोड़ा जाता है. बच्चों ibuprofen (100mg/5ml) के 100 मिलीग्राम एक मानक 473 मिलीलीटर कृंतक पानी की बोतल के लिए जोड़ा है. पशु दैनिक और imaged मनाया जाता है और हर 3 दिन तौला. दो सप्ताह अवलोकन आरोपण के बाद दो बार प्रति दिन बढ़ जाती है. पशु euthanized हैं जब वे गिरावट स्वास्थ्य जो hunched आसन, कम गतिशीलता और दिखाई शरीर के वजन घटाने (≥ 20%) शामिल हैं के लक्षण दिखाने. ये लक्षण ट्यूमर को प्रकाशित प्रतिक्रिया कर रहे हैं और वे reproducibly ट्यूमर के कारण मौत के लिए लगभग 1 दिन पहले दिखाई देते हैं.
4. Vivo में 3 इमेजिंग
- [लिविंग छवि] सॉफ्टवेयर शुरू करो.
- IVIS इमेजिंग प्रणाली [इनिशियलाइज़ IVIS सिस्टम] नियंत्रण कक्ष के नीचे दाईं ओर के बटन पर क्लिक करके initialized है.
- नियंत्रण कक्ष के ऊपर बाईं ओर पर [Luminescent] इमेजिंग मोड का चयन करें.
- इमेजिंग के इष्टतम समय luciferin इंजेक्शन के बाद एक काइनेटिक अध्ययन आवश्यक है निर्धारित चित्रा [3] यह वर्णन जुगनू luciferase के लिए है;
- जानवरों में, के रूप में नीचे वर्णित है, 10μl / जी डी luciferin जुगनू (पीबीएस में कैलिपर लाइफ साइंसेज XR-1001 कैटलॉग या अन्य विक्रेता से एक समान उत्पाद 15mg/ml) के शरीर के वजन इंजेक्षन.
- 3 मिनट रुको, और फिर यह गैस संज्ञाहरण कक्ष (2 हे में 2% Isoflurane गैस) में रखकर माउस anesthetize.
- बंद गैस चैम्बर के लिए संज्ञाहरण और संज्ञाहरण वाल्व और IVIS कई गुना करने के लिए वैक्यूम खोलने के मुड़ें. तुरंत बेहोश जानवर जगहतापमान नियंत्रित इमेजिंग मंच पर यकीन है कि माउस नथुने ठीक गैस संज्ञाहरण कई गुना में रखा गया है. पहली छवि लगभग 5 मिनट luciferin इंजेक्शन के बाद लिया जाना चाहिए. 5 पशुओं को IVIS स्पेक्ट्रम साधन में एक समय पर imaged किया जा सकता है. यदि कम से कम 5 पशुओं को imaged किया जा रहे हैं, यह संभव है अप्रयुक्त कई गुना (एस) को प्लग करने के लिए isoflurane गैस पर संरक्षण.
- करने के लिए छवियों के लिए एक अनुक्रम बनाने के एक घंटे के लिए luciferin अभिव्यक्ति के लिए एक काइनेटिक वक्र उत्पन्न द्वारा हर 3 मिनट लग करने के लिए जारी रखें.
- नियंत्रण कक्ष में [अनुक्रम सेटअप] बटन पर क्लिक करें.
- अनुक्रम संपादक प्रकट होता है.
- नियंत्रण कक्ष में, अनुक्रम में पहली bioluminescent छवि के लिए सेटिंग्स निर्दिष्ट करें.
- हम मध्यम Binning के साथ शुरू करने की सिफारिश.
- हम भी ऑटो एक्सपोजर के लिए इष्टतम जोखिम समय निर्धारित की सलाह देते हैं.
- [विलंब] अनुक्रम संपादक में बटन का चयन करेंएन डी प्रत्येक अधिग्रहण के बीच 3 मिनट की देरी समय निर्दिष्ट करें.
- पर क्लिक करें अनुक्रम संपादक में [जोड़ें]. अधिग्रहण मापदंडों तो मेज पर जोड़ रहे हैं.
- अनुक्रम में प्रत्येक छवि के लिए चरण 4 दोहराएँ.
- एक बार वक्र की स्थापना की है, इष्टतम इमेजिंग समय संकेत शक्ति (तीव्रता) बनाम समय की साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Vivo फोटान में उच्चतम समय छवि पशुओं के लिए मजबूत और सबसे सटीक संकेत मिलता है गिनती .
- प्रारंभिक प्रयोगों luciferin की intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) का इस्तेमाल किया, तथापि, आईपी इंजेक्शन कभी कभी आंतरायिक ट्यूमर में कोई bioluminescence थोड़ा दिखा परिणामों में परिणामस्वरूप. हम धारणा है कि संकेत के कभार यादृच्छिक कमी आंत्र या अन्य आंतरिक अंगों के लिए luciferin की डिलीवरी के कारण था. इसलिए हम चमड़े के नीचे (सुप्रीम कोर्ट) luciferin इंजेक्शन का उपयोग शुरू किया और अधिक से अधिक इमेजिंग reproducibility देखा [चित्रा 3].
- बीससुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन के बाद मिनट, जानवरों उन्हें एक कक्ष में 2% की Isoflurane गैस के साथ 2 हे में रखकर जब तक वे अनुत्तरदायी हैं anesthetized हैं .
- anesthetized जानवर (ओं) इमेजिंग कक्ष में ले जाया कर रहे हैं. नेत्र मरहम इमेजिंग की लंबाई की वजह से गतिज अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यह अन्य इमेजिंग प्रक्रियाओं के लिए की जरूरत नहीं है क्योंकि वे अवधि में कम कर रहे हैं.
- छवि मध्यम binning में एक 5 मिनट जोखिम समय के साथ हासिल कर ली है. ऑटो अधिग्रहण विकल्प भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- यदि संकेत संतृप्त है और / या मध्यम binning पर बेहोश, binning या जोखिम समय समायोजित किया जा सकता है.
- प्रोग्राम फ़ाइलों और बाद में छवि टिप्पणियों को उपयोगकर्ता के कंप्यूटर निर्देशिका में सहेजी जाती हैं.
5. 3 डी 3 इमेजिंग
- [अनुक्रम सेटअप] नियंत्रण कक्ष की खिड़की में [इमेजिंग विज़ार्ड] टैब पर क्लिक करें.
- [Bioluminescence] इमेजिंग विज़ार्ड प्रारंभ स्क्रीन पर इमेजिंग मोड और सीएल का चयन करेंick [अगला].
- "Bioluminescence - DLIT" इमेजिंग विज़ार्ड के खिड़की, फायर फ्लाई [] संवाददाता जांच का चयन करें. / चयनित जुगनू स्रोत स्पेक्ट्रम के उत्सर्जन और उत्तेजना छह इसी फिल्टर करने के लिए प्राप्त किया जा चयन के साथ दिखाई देंगे.
- पिछले स्क्रीन डिफ़ॉल्ट विकल्प है कि ऑटो जोखिम अधिग्रहण मानकों और देखें सी. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के फील्ड की एक बहुत अच्छी तरह से काम में शामिल के साथ दिखाई देगा, तथापि, इन सेटिंग्स यदि आवश्यक संशोधित किया जा सकता है.
- क्लिक करें [अगला] और अनुक्रम संपादक विंडो 20 विस्तृत फिल्टर (560 एनएम, 580 एनएम, 600nm, 620 एनएम, 640 एनएम, और 660nm) एनएम छह वर्णक्रमीय क्षेत्रों के अनुक्रम के साथ आबादी वाले हो जाएगा. प्रेस मोल अनुक्रम []. पहला फिल्टर (560 एनएम) एक संरचित प्रकाश एक लेजर galvanometer का उपयोग करने के लिए सतह स्थलाकृति स्थापित पैटर्न शामिल होंगे.
- उपकरण पैलेट में [सतह स्थलाकृति] टैब का चयन करें. भूतल चौरसाई पुनर्निर्माण की प्रक्रिया के दौरान बनाई गई किसी भी तेज कोण के लिए खाते में लागू किया जा सकता है.डिफ़ॉल्ट कम चौरसाई की सिफारिश की है.
- क्लिक करें [बनाएँ] टोमोग्राफी और विश्लेषण बॉक्स दिखाई देगा. फसल बॉक्स है कि पूरे जानवर शामिल ड्रा और फिर [अगला] क्लिक करें.
- दहलीज चयनित क्षेत्र पर एक बैंगनी मुखौटा उपकरण के रूप में दिखाई देगा. मुखौटा स्वचालित रूप से करने के लिए जानवर की तस्वीर मैच निर्धारित किया जाना चाहिए. यदि आवश्यक हो, मुखौटा की दहलीज को समायोजित करने के लिए और अधिक उचित जानवर की रूपरेखा फिट.
- पर क्लिक करें [समाप्त] और खंगाला जाल दिखाई देगा. पुनर्निर्माण तो परिणाम टैब में सहेजा जा सकता है.
- जानवर सतह स्थलाकृति के सृजन के बाद, [DLIT 3D पुनर्निर्माण] आगे बढ़ने के लिए उपकरण पट्टी पर ड्रॉप डाउन.
- [विश्लेषण] टैब के तहत सभी छह तरंगदैर्य का चयन करने के लिए पुनर्निर्माण प्रदर्शन. अचयनित छवियों है कि 600 से नीचे संतृप्त पिक्सल या मायने रखता है झुकेंगे. डिफ़ॉल्ट के रूप में [पैरामीटर] टैब में सेटिंग्स छोड़ो.
- [गुण] टैब के तहत, "बलवान" के लिए डिफ़ॉल्ट विकल्प के रूप में में सूचीबद्ध किया जाना चाहिएआर ऊतक के नजदीक, और "जुगनू" स्रोत के स्पेक्ट्रम के रूप में सूचीबद्ध किया जाना चाहिए.
- पर क्लिक करें टैब विश्लेषण के तहत फिर से संगठित], और जानवर की सतह और संकेत स्रोत की इसी पुनर्निर्माण के 3D पुनर्निर्माण [चित्रा 4] प्रकट करना चाहिए.
- संकेत स्थान और तीव्रता का निर्धारण करने के लिए, उपकरण पैलेट के 3D उपकरण टैब पर Voxels बटन का चयन करें.
- सभी प्रदर्शित voxels के आसपास एक वर्ग ड्रा और कुल प्रवाह माप मात्रा टैब के नीचे में दिखाया गया है.
- [मास के केंद्र] पर क्लिक करें चयनित voxels के संकेत स्थान की पहचान. जानवर के कोरोनल, बाण के समान और transaxial स्लाइस प्रकट [मापन कर्सर प्रदर्शन] का उपयोग करेंगे जानवर की सतह से voxel केंद्र के लिए दूरी को मापा जा सकता है.
- कृपया अंग atlases और अन्य उन्नत सुविधाओं के सह पंजीकरण पर अधिक जानकारी के लिए छवि सॉफ्टवेयर रहते उपयोगकर्ता पुस्तिका देखें.
6. एक डाटा3 nalysis
- बाद छवि हासिल कर ली है और बचाया, [ब्राउज़] बटन को क्लिक करके और फ़ाइल का चयन करके कार्यक्रम फ़ाइल का उपयोग करें.
- छवि जानकारी [देखें] के नीचे पाया जा सकता है → [छवि]
- संकेत की तीव्रता ब्याज (आरओआई) [आरओआई उपकरण] बटन के क्षेत्र का चयन करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है है. सुनिश्चित करें कि छवि छवि नियंत्रण कक्ष के ऊपरी बाएँ कोने पर ड्रॉप - डाउन सूची पर "फोटॉन" का चयन करके [फोटॉन] मोड के तहत विश्लेषण किया है.
- [मापन आरओआई] "प्रकार" ड्रॉप - डाउन सूची से बटन का चयन करें. ब्याज की रॉय आकार का चयन करें, विकल्प सर्किल, स्क्वायर, और ग्रिड या शामिल हैं. अधिग्रहीत छवि पर तीव्रता के सभी क्षेत्रों को कवर.
- आरओआई स्थिति bioluminescent संकेत युक्त क्षेत्र आरओआई आकार चयन खींचकर सेट कर दिया जाता है.
- रॉय के संकेत तीव्रता [उपाय] बटन पर क्लिक करके गणना है. आरओआई लेबल तीव्रता को प्रदर्शित करता है. आरओआई और प्रबंधित किया जा सकता है उसी बचायाएनजी जहाँ रहते हैं छवि सॉफ्टवेयर.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
सफल सेल आरोपण स्पष्ट है जब प्रत्यारोपित कोशिकाओं सर्जरी के दिन IVIS स्पेक्ट्रम का उपयोग detectable हैं. दोनों GL261 - ल्यूक और GL261 luc2 कोशिकाओं detectable हैं, तथापि, luc2 जीन bioluminescence के एक उच्च स्तर [चित्रा 5] प्रदान करेगा. आरोपण के बाद जल्द ही लिया छवियाँ जानवर के पंजे और नाक जो पृष्ठभूमि के रूप में अवहेलना किया जाना चाहिए पर गैर विशिष्ट संकेतन हो सकता है. आरोपण की साइट पर स्थित सिग्नल असली है और संकेत समय के साथ [6 चित्रा] में वृद्धि होगी. 6 दिन संकेत तीव्रता में गिरावट प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और सबसे ट्यूमर के नुकसान की वजह से होने की संभावना प्रत्यारोपित कोशिकाओं के कुछ लोगों द्वारा ले. ट्यूमर बोझ के मात्रात्मक माप प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि वे तेजी से वृद्धि जब तक पशु अंततः रोग के लिए succumbs चाहिए रहे हैं. हालांकि, विकास घटता प्रत्यारोपित कोशिकाओं के राज्य है, और या अपरिहार्य मामूली var पर काफी हद तक निर्भर करेगा आरोपण की प्रक्रिया में iability. हमारी प्रयोगशाला छवि प्रत्यारोपित पशुओं के लिए हर तीन दिन चुना है.
चित्रा 1 बाद ठीक anesthetized माउस है, यह stereotactic फ्रेम में रखा गया है. माउस सिर मुंह क्लैंप का उपयोग करने के लिए सुरक्षित है.
चित्रा 2 के बाद त्वचा खोला है ब्रैग्मा, राज्याभिषेक और बाण के समान sutures के शामिल मुख्य संरचनात्मक स्थलों सहित पहचाने जाते हैं . ब्रैग्मा के अधिकार के लिए 2.3mm burrhole धीरे - धीरे दबाव की एक छोटी राशि के साथ एक 16 गेज एक आधा इंच सुई घुमा जब तक खोपड़ी penetrated है और मस्तिष्क संपर्क में है के द्वारा बनाई गई है.
चित्रा 3 उपचर्म की गतिज तुलना (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "Alt =" / Figure3.1 ">) बनाम intraperitoneal ( 
) Luciferin इंजेक्शन उपचर्म luciferin इंजेक्शन की उपयोगिता का प्रदर्शन और छवि निम्नलिखित luciferin प्रशासन के लिए इष्टतम समय की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया था. तीन मिनट के बाद luciferin इंजेक्ट किया गया था बेहोश माउस, IVIS स्पेक्ट्रम साधन में रखा था और हर 3 मिनट के लिए imaged एक घंटे और हर 6 मिनट के लिए है कि बाद bioluminescence के एक काइनेटिक वक्र उत्पन्न करने के लिए. यह दिखा दिया कि luciferin प्रशासन के एक चमड़े के नीचे मार्ग हमारे हाथ में एक intraperitoneal इंजेक्शन के लिए बेहतर था, और जानवरों छवि के लिए इष्टतम समय लगभग 25 मिनट luciferin इंजेक्शन के बाद जब GL261 - ल्यूक कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया था कि.
एक 3 - आयामी reconst चित्रा 4 एकाधिक दृश्यGL261 - luc2 कोशिकाओं के intracranial आरोपण की हलचल माउस कंकाल और मस्तिष्क के साथ सह पंजीकृत किया.
चित्रा 5 फोटॉन GL261 - ल्यूक कोशिकाओं GL261 - luc2 कोशिकाओं बनाम से उत्पन्न ट्यूमर से प्राप्त मायने रखता है. परिणाम 5 पशुओं के एक औसत रहे हैं.
चित्रा 6 GL261 ल्यूक एक सूरजमुखी मनुष्य C57BL / 6 माउस में ट्यूमर सेल के विकास का ग्राफ़. Bioluminescence हर 3 दिनों में मापा गया था और vivo फोटॉन गिनती बनाम आरोपण के बाद के दिनों में के रूप में प्लॉट किए जाते हैं. फोटो विभिन्न समय बिंदुओं पर bioluminescence दिखा. रंगाई bioluminescence का एक संकेत (पिक्सेल तीव्रता) जो ट्यूमर सेल नंबर (रंग पट्टी सही करने के लिए दिखाया गया है) करने के लिए सापेक्ष है. बाद पशु रोग के आगे घुटने टेक दिए मस्तिष्क dissected और luciferin topically करने के लिए जोड़ा गया है पूर्व vivo imag प्राप्तई इनसेट आंकड़ा में दिखाया गया है.
Discussion
एक 0.4 मिमी जेब बनाने के बाद सेल inoculum 2.6 मिमी की गहराई में मस्तिष्क की सतह से संचार होता है. उचित और सुई के स्थान गहराई सुनिश्चित करने के एक एक्स - रे एक सी शाखा या इसी तरह की छवि एक्स - रे तेज डिवाइस का उपयोग कर लिया जा सकता है है, तथापि, यह वैकल्पिक है. सर्जरी की जटिलताओं अगर पशु ठीक से बेहोश नहीं है उठता है, जो बिंदु पर पशु सेल जलसेक के दौरान कदम हो सकता है. इस सेल या सुई ट्रैक से खून बह रहा है मिश्रण का रिसाव हो सकता है. कोशिकाओं के रिसाव ट्यूमर कोशिकाओं के अस्थानिक वृद्धि का कारण बनता है. यह भी नहीं जो किया जा सकता है वेंट्रिकल पंचर महत्वपूर्ण है अगर burrhole 2.3 मिमी 4 प्रोटोकॉल में वर्णित करने के लिए औसत दर्जे का बना है. सुई और सेल प्रसार के उचित स्थान 2 μl methylene नीले डाई के साथ एक माउस infusing और मस्तिष्क के ऊतकों विदारक संचार डाई के स्थान की जाँच के द्वारा परीक्षण किया गया था.
इस प्रोटोकॉल में हम vivo इमेजिंग प्रणाली और टी में IVIS स्पेक्ट्रम का इस्तेमाल किया हैवह छवि (4.0 v) सॉफ्टवेयर इस उपकरण के साथ उपयोग के लिए तैयार रहते हैं. (कैलिपर लाइफ साइंसेज). Vivo इमेजिंग सिस्टम और छवि विश्लेषण उपकरण में कोई तुलना करने के लिए इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन प्रणालियों परंपरागत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए एक प्रयोगात्मक intracranial ट्यूमर के विकास का पालन पर कुछ लाभ प्रदान करते हैं. सबसे स्पष्ट 2 उपकरणों के रिश्तेदार लागत जानवर एमआरआई मशीन कहीं अधिक महंगे हैं और आम तौर पर एक कुशल एमआरआई तकनीशियन की सेवाओं की आवश्यकता है. जैसे क्या यहाँ वर्णित किया गया था vivo इमेजिंग में अंत उपयोगकर्ता के द्वारा किया जा सकता है . bioluminescence डेटा मात्रात्मक है, जबकि एमआरआई डेटा के quantitation समय लेने वाली और कुछ हद तक अयथार्थ है. इसके अलावा, एमआरआई छवियों edema और ट्यूमर कोशिकाओं के अलावा में सूजन दिखाने के लिए और यह मुश्किल हो सकता है उपचार के प्रभाव से ट्यूमर अलग कर सकते हैं. इन कारणों के लिए बढ़ ट्यूमर की सटीक बड़ा माप प्राप्त करने के लिए एक चुनौती हो सकती है. Bioluminescence एटीपी की आवश्यकताइसलिए ही रहने वाले ट्यूमर कोशिकाओं ट्यूमर का आकार डेटा के लिए योगदान. इस के बावजूद, वहाँ एमआरआई के लिए कुछ लाभ कर रहे हैं अगर एक मशीन उपलब्ध है. कक्ष एक bioluminescent एमआरआई द्वारा visualized किया जा मार्कर के साथ लेबल नहीं किया जा है. पेरी-tumoral edema कल्पना करने की क्षमता कुछ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए एक लाभ हो सकता है. दोनों प्रौद्योगिकियों के एक ताकत है कि का उपयोग कर एक दूसरे का उपयोग नहीं रोकता है, तो डेटा ट्यूमर के विकास के रूप में अच्छी तरह के रूप में पेरी tumoral और एक ही पशु से edema सूजन की उपस्थिति पर प्राप्त किया जा सकता है जब दोनों प्रौद्योगिकियों उपलब्ध हैं शोधकर्ता के लिए.
Disclosures
इस अनुच्छेद के लिए नि: शुल्क प्रवेश कैलिपर लाइफ साइंसेज द्वारा प्रायोजित है.
Acknowledgments
हम lentivirus GL261 - ल्यूक कोशिकाओं की तैयारी पर उपयोगी सुझाव के लिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रणाली माहिल राव के लिए plasmids के उदार उपहार के लिए डा. यहोशू बी रुबिन स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
हम SSBTR ब्रेन ट्यूमर () अनुसंधान, बैरो स्नायविक फाउंडेशन और अपने उदार सहायता के लिए वालेस फाउंडेशन सहायक छात्र धन्यवाद.
जानवरों पर प्रयोग संस्थागत पशु देखभाल और सेंट जोसेफ अस्पताल और मेडिकल सेंटर का प्रयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GL261-luc2 Bioware Ultra | Caliper Life Sciences | GL261-luc2 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 10313039 | |
| Geneticin (G418) | GIBCO, by Life Technologies | 11811-023 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 26140079 | |
| Phospate Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 70011044 | |
| C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Mice | National Cancer Institute | ||
| AKWA Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Inc | 17478-062-35 | |
| Ketaset (ketamine hydrochloride) | Wyeth Animal Health | 11570775 | |
| Sedazine (xylazine hydrochloride) | Wyeth Animal Health | 10031894 | |
| Small Animal Stereotaxic Instrument | Kopf Instruments | 900 | |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments, Inc. | UMP3-1 | If not available, it is possible to infuse manually |
| 10μl syringe with 26 gauge beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | SGE010RNS | |
| Adison Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 500092 | |
| Penfield Dissector | Codman | 65-1015 | |
| 16g 1½ Precision Glide Needle | BD Biosciences | 305198 | |
| Surgical Blade Handle | BD Biosciences | 371030 | |
| Size 15 Blade | BD Biosciences | 371315 | |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon Inc. | VCP496G | |
| Bone Wax | Medline Industries | DYNJBW25 | |
| Povidine-Iodine Swab Sticks | Medline Industries | MD93901 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Caliper Life Sciences | 122796 | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| OPMI Pentero Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Any surgical microscope will suffice | |
| Xenogen IVIS Spectrum with optional anesthesia system | Caliper Life Sciences |
References
- Candolfi, M. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. J Neurooncol. 85, 133-148 (2007).
- Stafford, P., Abdelwahab, M. G., do, K. im, Preul, Y., Rho, M. C., M, J., Scheck, A. C. The ketogenic diet reverses gene expression patterns and redudes reactive oxygen species levels when used as an adjuvant therapy for glioma. Nutr Metab. 7, (2010).
- Caliper Life Sciences, Inc. Living Image Software Version 4.0. VivoVision Systems. , (2010).
- Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 2nd Ed, Academic Press. (2001).
- Jouanneau, E., Poujol, D., Gulia, S., Le, M. I., Blay, J. Y., Belin, M. F. Dendritic cells are essential for priming but inefficient for boosting antitumour immune response in an orthotopic murine glioma model. Cancer Immunol Immunother. 55, 254-267 (2006).
