Fisyon maya,<em> Schizosaccharomyces pombe</em> Temel hücresel süreçleri incelemek için iyi bir model sistemdir. Burada fizyon maya kantitatif canlı hücre analizi gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu deneyde hücre çekirdeğinin içinde genom organizasyonu odaklanır, fakat yöntem sitozolik faktörleri incelemek için de kullanılabilir.
Birkaç mikroskopi teknikleri, hücre içinde belirli bir proteinin tespit edebilir bugün mevcuttur. Son on yılda ilgi protein doğrudan bağlı Yeşil Floresan Protein (GFP) gibi fluorochromes kullanarak canlı hücre görüntüleme 1 giderek daha popüler hale gelmiştir. GFP ve benzer fluorochromes kullanma proteinlerin hücre içi lezyonlar ve hareketleri bir floresan mikroskop tespit edilebilir. Ayrıca, bu tekniği kullanarak bir kromozomun belli bir bölgesine subnuclear lokalizasyon okudu olabilir. GFP Lac repressör protein (LacR) erimiş ve ektopik Laço dizisi tandem tekrarlar kromozom 2 faiz bölgeye eklenmiştir hücrede ifade edilir. LacR-GFP Laço tekrarlar ve genom o bölgede, floresan mikroskop yeşil bir nokta olarak görülebilir yapışacaktır . Maya özellikle homolog yılından bu yana bu tür manipülasyon için uygundurrekombinasyon çok etkili olduğu ve böylece Laço tekrarlar ve GFP 3 ile mühendislik füzyon proteinleri hedeflenen entegrasyon sağlar. Burada fizyon maya canlı hücre analizi için kantitatif bir yöntem açıklanmaktadır. Fisyon maya canlı hücre analizi için ek protokoller bulunabilir, mayotik kromozom davranışları 4 bir film yapmak nasıl örneğin. Bu deneyde biz subnuclear organizasyon ve gen indüksiyonu sırasında nasıl etkilenir. Biz genleri çevresinde Laço bağlayıcı sitelerinin giriş Chr1 adlı bir gen kümesinin, etiketli. Gen küme fisyon maya 5 azot açlık sırasında erken uyarılan gen zenginleştirilmiştir. Gerilim nükleer membran (NM), kırmızı floresan sinyal sebebiyet veren NM proteini Cut11 mCherry eki etiketli. Mil Pole gövde (SPB) bileşik Sid4 Kırmızı Floresan Protein (Sid4-MRFP) 6 eritilir. </s>. Vejetatif büyüyen maya hücreleri sentromerlere her zaman NM 7 gömülü olan SPB bağlıdırlar . SPB NM büyük bir yuvarlak yapı olarak tanımlanır. Azot kaynağı tükenmesi önce görüntüleme ve 20 dakika sonra gen kümesi (GFP) ve NM / SPB arasındaki mesafe belirleyebilirsiniz. Azot tükenmesi öncesi ve sonrası ortalama veya medyan mesafeler karşılaştırılır ve böylece azot tükenmesi sonra gen küme hücre içi lokalizasyonu bir kayma var olup olmadığını ölçmek.
Hücresel olayları izlemek için canlı hücre görüntüleme kullanımı son on yılda giderek daha popüler hale gelmiştir. Bu denizanası Aequorea victoria Yeşil Floresan Protein kullanımı ile başladı ve şimdi birçok farklı fluorochromes kadar kırmızı (648 nm) 11 cyan (475 nm) geniş bir spektrumları yoluyla yayan floresan mevcuttur. Immünofloresan üzerinden canlı hücre görüntüleme en önemli avantajlarından biri, hücreleri, dolayısıyla tespit süreci mümkün eserler kaçınarak mikroskopi önce formaldehit veya etanol / aseton tedavisi sabit değildir olduğunu. Buna ek olarak, tek tek hücrelerin izleyin ve hücresel olaylar 12 film elde etmek için mümkün kılan, inkübasyon saat veya gün boyunca sık aralıklarla fotoğraf çekmek için, canlı hücre görüntüleme imkanı sunar . Memeli hücreleri gibi yaklaşık 3-4 çapında küçük maya hücresi ile karşılaştırıldığında yaklaşık 100 mm çapları, daha büyük bir boyuta sahip olmanın avantajına sahipMu; m. Öte yandan, maya ile avantajı kolayca manipüle genom. Homolog rekombinasyon maya çok verimli bir şekilde ortaya çıkar ve farklı fluorochromes 3 ilgi proteinleri kaynaştırmak için kullanılır . Ayrıca, Laço LacR-GFP protein dizileri ve daha sonraki ifade hedeflenen entegrasyon kullanarak belirli bir kısmının, hücre çekirdeği 2 içinde genom algılanmasını sağlar . S. Kullanımı mikroskopi pombe hücreleri düşük maliyetli hücre kültürü koşullarında hızlı bir nesil zaman yetişen doğal tek hücreli organizmalar olduğundan ek avantajları vardır. Ayrıca, S. metazoan homolog genler beri pombe mükemmel ökaryotik bir model organizmadır.
Bu tekniğin en önemli sınırlamaları Bir gerçek sinyal algılama rahatsız maya hücre otofloresans. Bu sorun, filtre sterilize glikoz minimal büyüme ortamını kullanarak yerine otoklava üstesinden gelinebilir. IçindeAyrıca maya hücreleri, bunları montaj log fazı 2 gün önce yetiştirilen edilmelidir. Burada sunulan protokol maya hücre içindeki proteinlerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek için nispeten basit, ama henüz nicel bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, farklı zaman noktalarında fotoğraf çekmek hücresel olayları takip edebilirsiniz.
The authors have nothing to disclose.
Profesör Hiraoka Biz bize suşları göndermek için teşekkür ederim. Biz Goran Gustafssons Vakfı ve İsveç Kanser Derneği (2008/939) desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comment |
Lectin | Sigma | L1395 | |
Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Zeiss | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |