分裂酵母、<em>シゾサッカロマイセスポンベ</em>、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。
いくつかの顕微鏡技術は、細胞内の特定のタンパク質を検出することができる、今日利用可能です。過去10年間の間に直接、目的のタンパク質に接続された緑色蛍光タンパク質(GFP)のような蛍光色素を用いた生細胞のイメージングは、1人気が高まっています。 GFPと同様の蛍光色素を用いてタンパク質の細胞内ローカライゼーションと動きを蛍光顕微鏡で検出することができます。また、また、染色体の特定の領域の核内局在性は、この手法を用いて研究することができます。 GFPは、Lacリプレッサータンパク質(LacR)に融合させ、異所的lacO配列のタンデムリピートが染色体2上の関心領域に挿入されている細胞内で発現されています。 LacR – GFPは、lacOの繰り返しにバインドされ、ゲノムのその領域は、蛍光顕微鏡で緑色のドットとして表示されます。酵母は、特に相同ので、このタイプの操作に適しています組換えは、非常に効率的であり、それによってlacOを繰り返すとGFP 3人工融合タンパク質の標的を統合することができます。ここでは、分裂酵母の生細胞解析のための定量的な方法を説明します。分裂酵母の生細胞解析のための追加のプロトコルは、減数分裂の染色体の行動の4のムービーを作成する方法の例については、見つけることができます。この特定の実験では核内の組織とそれがどのように遺伝子の誘導中に影響を受けているに焦点を当てる。我々は、遺伝子の近傍にlacO結合部位を導入することにより、塩基番号という名前の遺伝子クラスターを、、ラベルを貼っている。遺伝子クラスターは、分裂酵母5の窒素飢餓時に早期に誘導される遺伝子を濃縮される。株では核膜(NM)が赤色蛍光シグナルを生じさせるNMタンパク質Cut11にmCherryを接続してラベルが付けられます。紡錘体極体(SPB)化合物Sid4は、赤色蛍光タンパク質(Sid4 – MRFP)6に融合させる</s上>。栄養成長している酵母細胞では動原体は常にNM 7に埋め込 まれているSPBに添付されています。 SPBは、NMの大きな丸い構造として識別されます。前の画像と20分窒素源の枯渇後に我々は、遺伝子クラスター(GFP)とNM / SPBの間の距離を決定することができます。窒素の枯渇の前と後の平均値や中央値の距離が比較され、我々は、このように窒素の枯渇後の遺伝子クラスターの細胞内局在の変化があるか否かを定量化することができます。
過去10年間中に携帯電話のイベントを監視するための生細胞イメージングの使用は、ますます人気となっている。それはクラゲオワンクラゲから緑色蛍光タンパク質の使用を開始し、現在多くの異なる蛍光色素は、シアン(475 nm)から遠赤(648 nm)を11に幅広いスペクトルを介して発光蛍光ご利用いただけます。免疫上の生細胞イメージングの大きな利点の一つは、細胞がそれ故に固定のプロセスから可能なアーチファクトを避けること、顕微鏡の前にホルムアルデヒドやエタノール/アセトン処理により固定されていないということです。さらに、生細胞イメージングでは、個々のセルを追跡し、携帯電話のイベント12の動画を取得することが可能となり、インキュベーションの数時間または数日中に頻繁な間隔で写真を撮るために可能性を提供しています。哺乳動物細胞は、約3〜4&の直径を小さく酵母細胞に比べ、約100μmの直径で、大きいサイズを有するという利点を持っているムー、M.一方、酵母の利点は、操作が簡単なゲノムである。相同組換えが酵母で非常に効率的に発生し、異なる蛍光色素3に目的のタンパク質を融合するために使用されます。また、lacOシーケンスとLacR – GFPタンパク質のその後の発現の標的との統合を使用すると、細胞核2内のゲノムの特定の部分の検出を可能にする。 S.の使い方彼らは低コストの細胞の培養条件での高速生成時間とともに成長する自然な単細胞生物なので、顕微鏡での分裂酵母細胞は、追加の利点があります。また、S.分裂酵母は、後生動物の相同遺伝子を持っているので、優れた真核生物のモデル生物です。
この手法の主要な限界の一つは、真の信号の検出を妨害する酵母細胞における自家蛍光である。この問題は、代わりにオートクレーブのフィルター滅菌グルコースと最小限の増殖培地を使用することで解決できます。のさらに、酵母細胞は、それらをマウントする前に、ログフェーズで2日間増殖されるべきである。ここで紹介するプロトコルは、酵母細胞内のタンパク質の細胞内局在を決定するために比較的単純な、まだ定量的な方法を提供しています。また、異なる時点で写真を撮ることによって我々は携帯電話のイベントを続けることができます。
The authors have nothing to disclose.
私達は私達の株を送信するための教授平岡に感謝。我々は、ゴランGustafssons財団とスウェーデンの癌協会(939分の2008)からの支援を認める。
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comment |
Lectin | Sigma | L1395 | |
Silicon grease | Dow Corning | ||
Laser scanning microscope LSM 700 |
Zeiss | LSM 700 | Other confocal microscope could be used. |
SigmaStat3.5 | Statcon | SigmaStat3.5 | Any software for statistical analysis could be used. |