Isolamento e Purificação de cinesina partir Drosophila Os embriões
Summary
Este é um protocolo para isolar cinesina comprimento ativo total de<em> Drosophila</em> Embriões de molécula única estudos biofísicos. Nós mostramos como coletar embriões, faça o lisado embrião, e depois polimerizar microtúbulos (MTs). Cinesina é purificado por imobilizando-a sobre o MTS, fiação para baixo os complexos cinesina MT-e, em seguida libertando o cinesina a partir do MTs via adição de ATP.
Abstract
Proteínas motoras mover cargas ao longo dos microtúbulos, e transportá-los às especificidades sub-celulares locais. Como o transporte alteradas é sugerido para subjacentes uma variedade de doenças neurodegenerativas, compreendendo microtúbulo base de transporte do motor e da sua regulação, provavelmente, em última análise, levar a abordagens terapêuticas melhoradas. Cinesina-1 é uma proteína do motor eucariótica que se move numa direcção anterógrada (plus-fim) ao longo de microtúbulos (MTS), alimentado por hidrólise de ATP. Relatamos aqui um protocolo de purificação para isolar detalhada cinesina comprimento activo total a partir de embriões de Drosophila, permitindo assim que a combinação de Drosophila genética com molécula única estudos biofísicos. Começando com cerca de 50 copos de poedeiras, com cerca de 1000 mulheres por xícara, foram realizadas coletas durante a noite. Isto forneceu cerca de 10 ml de embriões embalados. Os embriões foram lixívia dechorionated (rendendo aproximadamente 9 gramas de embriões), e, em seguida, homogeneizada. Afperturbação ter, o homogeneizado foi clarificada usando uma velocidade de centrifugação de baixa seguido por uma centrifugação de alta velocidade. O sobrenadante clarificado foi tratada com GTP e taxol para polimerizar MTs. Cinesina foi imobilizada em polimerizada MTs adicionando o análogo de ATP, 5'-ciclase imidodiphosphate à temperatura ambiente. Depois de cinesina de ligação, os microtúbulos foram sedimentadas por meio de centrifugação a alta velocidade através de uma almofada de sacarose. O sedimento de microtúbulos foi então re-suspenso, e este processo foi repetido. Finalmente, o ATP foi adicionado para libertar o cinesina a partir do MTs. Centrifugação a alta velocidade, em seguida, centrifugadas a MTS, deixando a cinesina no sobrenadante. Este cinesina foi submetido a uma filtração centrífuga usando um corte 100 KD fora do filtro para a purificação adicional, aliquotadas, encaixe congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C. Electroforese em gel SDS e Western blotting foi realizada utilizando a amostra purificada. A actividade motora das amostras purificadas antes e após o passo de filtração final centrífugafoi avaliada usando um ensaio di vitro única molécula de microtúbulos. As fracções cinesina antes e depois da filtração centrífuga mostrou processabilidade como previamente relatados na literatura. Outros experimentos estão em andamento para avaliar a interação entre cinesina e outras proteínas de transporte relacionados.
Protocol
Discussion
Cérebro de bovino é o material mais amplamente utilizado de partida 11 para purificar full-length cinesina, embora cérebro de murídeo tem sido utilizado como bem 12. Uma grande desvantagem da utilização de cérebro de bovino como fonte de cinesina é a disponibilidade de material de partida fresco: matadouros são tipicamente inacessível, eo cérebro deve ser extremamente fresco, a fim de obter cinesina activo. Além disso, apenas os cérebros de vacas jovens são eficazes. Finalmente, a man…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecimentos especiais a Kris Ngai e Jason Del Rio, pelo apoio e ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado por RO1 concessão GM070676 para SPG.
Materials
| Name of the reagent or material | Company | Catalogue number | Comments |
| Agar (Granulated) | Fisher | 1423-500 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydrous | Fisher | D16-3 | |
| Petri Dishes | Becton | 35 1007 | 60x15mm Style (Polyester) 20/bag |
| Drosophila Culture Vials | UCI | ||
| Tricorn beaker | Econo Lab Inc. | B700-100 | Volume:100ml, size: 58x72mm |
| Yeast | Red Star | 2751 | |
| Nylon Mesh | Genesse Scientific | 57-102 | 120 micron pore size |
| Nylon Mesh | Small Parts | 06-350/35 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Pipes | Sigma | 108321-27-3 | |
| Glycerol | Fisher | 56-81-5 | |
| EGTA | Sigma | 67-42-5 | |
| MgS04(Anhydrous) | Fisher | 7487-88-9 | |
| PMSF | Sigma | 329-98-6 | |
| Leupeptin | Sigma | 103476-89-7 | |
| Aprotonin | Sigma | 9087-70-1 | |
| TAME | Sigma | 178403-8 | |
| STI | Calbiochem | 65635 | |
| GTP | Sigma | 36051-31-7 | |
| Taxol | Sigma | 33069-62-4 | |
| ATP analog 5′-adenylyl imidodiphosphate | Sigma | 3605-31-7 | |
| NaCl | Mallinckrodt | 7647-14-5 | |
| ATP | Sigma | 74804-12-9 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filters: .5 mL, 100kD cut off, 8 pack | Millipore | UFC510008 |
Riferimenti
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