Мультиплексный одиночных молекул группы Протеолиз измерений с использованием магнитных пинцет
Summary
В этой статье мы рассмотрим использование магнитного пинцета, чтобы изучить влияние силы на ферментативную протеолиза на одном уровне молекулы хорошо подходит для распараллеливания образом.
Abstract
Генерация и детектирование механических сил вездесущий аспект физиологии клетки, имеет непосредственное отношение к раку метастазов 1 атерогенеза 2 и заживление раны 3. В каждом из этих примеров, клеток и оказывают силы на свое окружение и одновременно ферментативно реконструируют внеклеточного матрикса (ECM). Влияние сил на ECM, таким образом, стать зоной значительный интерес в связи с его вероятной биологической и медицинской значение 4-7.
Одноместный методы молекулы, такие как оптического захвата 8, атомно-силовой микроскопии 9 и магнитного пинцета 10,11 позволяют исследователям исследовать функции ферментов на молекулярном уровне, оказывая сил на отдельные белки. Из этих методов магнитного пинцета (MT) отличаются низкой стоимостью и высокой пропускной способностью. МТ оказывают силы в диапазоне ~ 1-100 пН и может обеспечить миллисекунды временным разрешением,качества, которые хорошо подходят к изучению ферментов механизм на одной молекуле уровне 12. Здесь мы сообщаем хорошо подходит для распараллеливания MT анализ для изучения влияния силы на протеолиз отдельных молекул белка. Приведем конкретный пример протеолиза тримерной пептид коллагена матричной металлопротеиназы 1 (ММР-1), однако этот анализ может быть легко адаптирована для изучения других субстратов и протеаз.
Protocol
Discussion
Этот протокол описывает новое применение классических единой методике молекулы. Магнитный пинцет позволяет средней и высокой пропускной одной молекулы анализов в экономически эффективным способом. Однако, как и все экспериментальные методы существуют проблемы и потенциальные подв?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии в Научно-интерфейс (ARD), Национального института здравоохранения через Новая программа Новатор премии NIH директора 1-DP2-OD007078 (ARD), Уильям Bowes младший Стэнфордского стипендий (ASA ) и Стэнфордского института сердечно-сосудистой Младший Predoctoral стипендий (x). Авторы выражают благодарность Джеймсу Spudich для кредитования микроскопии оборудования.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Riferimenti
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
