Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet
Summary
In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.
Abstract
Het genereren en detectie van mechanische krachten is een alomtegenwoordig aspect van de cel fysiologie, met directe relevantie voor kanker metastase 1, 2 en atherogenese wondgenezing 3. In elk van deze voorbeelden cellen zowel uitoefenen van kracht op de omgeving en tegelijkertijd enzymatisch vorm van de extracellulaire matrix (ECM). Het effect van krachten op ECM is zo uitgegroeid tot een gebied van groot belang vanwege de mogelijke biologische en medische belang 4-7.
Enkel molecuul technieken zoals optische trapping 8, atomic force microscopie 9, en magnetische pincet 10,11 kunnen de onderzoekers om de functie van enzymen op moleculair niveau door het uitoefenen van krachten op afzonderlijke eiwitten te onderzoeken. Van deze technieken, magnetische pincet (MT) zijn opmerkelijk vanwege hun lage kosten en hoge doorvoer. MT oefenen krachten in het bereik van 1-100 ~ pN en kunnen milliseconde temporele resolutiekwaliteiten die goed zijn voor de studie van enzym-mechanisme afgestemd op de single-molecule level 12. Hier rapporteren een zeer parallelizable MT assay het effect van kracht op de Proteolyse van een eiwitmoleculen bestuderen. Wij geven het specifieke voorbeeld van de Proteolyse van een trimere collageen peptide matrix metalloproteinase 1 (MMP-1), maar deze assay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere substraten en proteasen bestuderen.
Protocol
Discussion
Dit protocol beschrijft een nieuwe toepassing voor een klassieke single molecule techniek. Magnetisch pincet laten medium tot high-throughput enkel molecuul testen op een kosten-efficiënte manier. Echter, net als alle andere experimentele technieken zijn er uitdagingen en mogelijke valkuilen.
Beperkingen van magnetische pincet
In vergelijking met een optische val van de ruimtelijke en temporele resolutie van een MT apparaat is laag. Bovendien is de krachten opgewek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Burroughs Wellcome Career Award op het Wetenschappelijk Interface (ARD), de National Institutes of Health door New Innovator Award van de NIH Director's Programma 1-DP2-OD007078 (ARD), de William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ), en aan de Stanford Cardiovascular Institute Jongere Predoctoraal Fellowship (JC). De auteurs danken James Spudich voor lenen microscopie apparatuur.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Riferimenti
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
