Multiplexed Einzelmolekül-Kraftspektroskopie Proteolyse Messungen mit magnetischen Pinzette
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von magnetischen Pinzette, um die Wirkung von Gewalt auf enzymatische Proteolyse auf der Ebene einzelner Moleküle in einem hoch parallelisierbaren Weise zu studieren.
Abstract
Die Erzeugung und Detektion von mechanischen Kräften ist ein allgegenwärtiges Aspekt der Zellphysiologie, mit unmittelbarer Relevanz für Krebsmetastasen 1, 2 und Atherogenese Wundheilung 3. In jedem dieser Beispiele, Zellen sowohl üben eine Kraft auf die Umgebung und gleichzeitig enzymatisch Umgestaltung der extrazellulären Matrix (ECM). Die Wirkung von Kräften auf ECM Damit hat sich zu einem Gebiet von großem Interesse wegen seiner wahrscheinlich biologischen und medizinischen Bedeutung 7.4.
Einzelmolekül-Techniken wie optische Fallen 8, Rasterkraftmikroskopie 9, 10,11 und magnetische Pinzette können die Forscher die Funktion von Enzymen auf molekularer Ebene durch Ausüben von Kräften auf einzelne Proteine zu untersuchen. Dieser Techniken sind magnetische Pinzette (MT) zeichnen sich durch ihre niedrigen Kosten und hohen Durchsatz. MT üben Kräfte im Bereich von ~ 1-100 pN und kann Millisekunde zeitlicher Auflösung liefern,Qualitäten, die gut auf das Studium der Enzym-Mechanismen sind unter der Einzel-Molekül-Ebene 12 angepasst. Hier berichten wir über ein hoch parallelisierbaren MT-Assay um die Wirkung der Kraft auf die Proteolyse einzelner Protein-Moleküle zu studieren. Wir stellen die spezielles Beispiel der Proteolyse eines trimeren Kollagenpeptid von Matrix-Metalloproteinase 1 (MMP-1), aber diese Assay kann leicht angepasst werden, auf andere Substrate und Proteasen zu untersuchen.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine neue Verwendung für ein einzelnes Molekül klassischen Technik. Magnetische Pinzetten erlauben mittel-bis High-Throughput-Assays einzelnes Molekül in einer kosteneffizienten Weise. Jedoch, wie alle experimentellen Techniken gibt es Herausforderungen und mögliche Fallstricke.
Grenzen der magnetischen Pinzette
Im Vergleich zu einer optischen Falle die räumliche und zeitliche Auflösung eines MT Vorrichtung niedrig ist. Darüber hin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Burroughs Wellcome Career Award in der Scientific Interface (ARD), die National Institutes of Health durch New Innovator des NIH Regiepreis Programm 1-DP2-OD007078 (ARD), die William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA unterstützt ) und der Stanford Cardiovascular Institute Jüngere Promotionsstipendium (JC). Die Autoren danken James Spudich für das Ausleihen Mikroskopie Ausrüstung.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Riferimenti
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