Summary

Multiplex singola molecola Forza Misure proteolisi con delle pinzette magnetiche

Published: July 25, 2012
doi:

Summary

In questo articolo si descrivono l'uso di una pinzetta magnetici per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi enzimatica a livello di singola molecola in modo altamente parallelizzabile.

Abstract

La generazione e la rilevazione delle forze meccaniche è un aspetto onnipresente della fisiologia cellulare, con rilevanza diretta per metastasi tumorali 1, 2 e aterogenesi la guarigione della ferita 3. In ciascuno di questi esempi, le cellule sia esercitare una forza sul loro ambiente e contemporaneamente enzimaticamente rimodellare la matrice extracellulare (ECM). L'effetto delle forze di ECM è diventata così una zona di notevole interesse per la sua importanza biologica e medica probabile 4-7.

Tecniche di singola molecola come intrappolamento ottico 8, 9 microscopia a forza atomica, e pinzette magnetici 10,11 consentono ai ricercatori di sondare la funzione di enzimi a livello molecolare esercitando forze su singole proteine. Di queste tecniche, pinzette magnetiche (MT) si distinguono per il loro basso costo ed elevate prestazioni. MT esercitare forze nell'intervallo di 1-100 ~ pN e può fornire risoluzione temporale millisecondo,qualità che sono ben abbinate allo studio del meccanismo enzimatico a singola molecola di livello 12. Qui riportiamo un saggio MT altamente parallelizzabile per studiare l'effetto della forza sulla proteolisi di singole molecole proteiche. Presentiamo l'esempio specifico della proteolisi di un peptide collagene trimerico da metalloproteinasi della matrice 1 (MMP-1), tuttavia, questa analisi può essere facilmente adattato per studiare altri substrati e proteasi.

Protocol

1. Cella di flusso Preparazione Vetrini coprioggetto (# 1.5, 22×22 mm e 22×40 millimetri, VWR) vengono puliti con ultrasuoni. Aggiungere i coprioggetti ad un piccolo contenitore di vetro capace di contenere coprioggetto e montaggio nel sonicatore (vedi punto 2). Riempire il contenitore con isopropanolo e sonicare in un bagno sonicatore per 20 minuti. Eliminare l'isopropanolo e sciacquare i coprioggetti con abbondanti quantità di acqua deionizzata prodotta da un apparato Barns…

Discussion

Questo protocollo descrive un nuovo uso per una tecnica classica singola molecola. Pinzette magnetiche consentono medio high-throughput saggi singola molecola in un modo economicamente efficiente. Tuttavia, come tutte le tecniche sperimentali ci sono sfide e le insidie ​​potenziali.

Limitazioni di pinzette magnetiche

Rispetto ad una trappola ottica la risoluzione spaziale e temporale di un apparato MT è bassa. Inoltre, le forze generate dal MT semplice qui desc…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal Career Award Burroughs Wellcome a livello di interfaccia scientifico (ARD), il National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award 1-DP2-OD007078 (ARD), il William Bowes Jr. Stanford Graduate Fellowship (ASA ), e la Stanford Cardiovascular Institute Fellowship Giovane Predoctoral (JC). Gli autori ringraziano James Spudich prestito attrezzature per microscopia.

Materials

Name of Reagent Company Catalogue Number
Micro Cover Glass #1.5 (22×22) VWR 48366-067
Micro Cover Glass #1.5 (22×40) VWR 48393-048
Lambda DNA Invitrogen 25250-010
T4 DNA Ligase Invitrogen 15224-041
Microcon Ultracel YM-100 Millipore 42413
Anti-Digoxigenin Roche Diagnostics 11-333-089-001
Tween 20 Sigma P9416-100ML
Anti-myc Antibody Invitrogen 46-0603
Bovine Serum Albumin Sigma B4287-5G
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 658.01D
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin Invitrogen 658.01D
p-Aminophenylmercuric Acetate Calbiochem 164610
Biotin-Maleimide Sigma Aldrich B1267
Biotin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Digoxigenin labeled oligo IDT DNA Custom synthesis
Collagen peptide gene DNA 2.0 Custom synthesis
MMP-1 cDNA Harvard Plasmid Database  
z-translator Thorlabs MTS50
Servo controller for translator Thorlabs TDC001

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (65), e3520, doi:10.3791/3520 (2012).

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