В этой статье мы рассмотрим использование магнитного пинцета, чтобы изучить влияние силы на ферментативную протеолиза на одном уровне молекулы хорошо подходит для распараллеливания образом.
Генерация и детектирование механических сил вездесущий аспект физиологии клетки, имеет непосредственное отношение к раку метастазов 1 атерогенеза 2 и заживление раны 3. В каждом из этих примеров, клеток и оказывают силы на свое окружение и одновременно ферментативно реконструируют внеклеточного матрикса (ECM). Влияние сил на ECM, таким образом, стать зоной значительный интерес в связи с его вероятной биологической и медицинской значение 4-7.
Одноместный методы молекулы, такие как оптического захвата 8, атомно-силовой микроскопии 9 и магнитного пинцета 10,11 позволяют исследователям исследовать функции ферментов на молекулярном уровне, оказывая сил на отдельные белки. Из этих методов магнитного пинцета (MT) отличаются низкой стоимостью и высокой пропускной способностью. МТ оказывают силы в диапазоне ~ 1-100 пН и может обеспечить миллисекунды временным разрешением,качества, которые хорошо подходят к изучению ферментов механизм на одной молекуле уровне 12. Здесь мы сообщаем хорошо подходит для распараллеливания MT анализ для изучения влияния силы на протеолиз отдельных молекул белка. Приведем конкретный пример протеолиза тримерной пептид коллагена матричной металлопротеиназы 1 (ММР-1), однако этот анализ может быть легко адаптирована для изучения других субстратов и протеаз.
Этот протокол описывает новое применение классических единой методике молекулы. Магнитный пинцет позволяет средней и высокой пропускной одной молекулы анализов в экономически эффективным способом. Однако, как и все экспериментальные методы существуют проблемы и потенциальные подв?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Карьера Burroughs Wellcome премии в Научно-интерфейс (ARD), Национального института здравоохранения через Новая программа Новатор премии NIH директора 1-DP2-OD007078 (ARD), Уильям Bowes младший Стэнфордского стипендий (ASA ) и Стэнфордского института сердечно-сосудистой Младший Predoctoral стипендий (x). Авторы выражают благодарность Джеймсу Spudich для кредитования микроскопии оборудования.
Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
z-translator | Thorlabs | MTS50 |
Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |