Multiplexade enda molekyl Force proteolys Mätningar med Magnetic pincett
Summary
I den här artikeln beskriver vi användandet av magnetiska pincett för att studera effekten av kraft på enzymatisk proteolys vid den enda molekyl nivå på ett mycket parallelliserbart sätt.
Abstract
Generering och detektering av mekaniska krafter är en allestädes närvarande del av cellens fysiologi, med direkt relevans för cancer metastaser 1, aterogenes 2 och sårläkning 3. I vart och ett av dessa exempel, celler både utövar kraft på sin omgivning och samtidigt enzymatiskt remodel den extracellulära matrisen (ECM). Effekten av krafter på ECM har därmed blivit ett område av stort intresse på grund av dess sannolika biologiska och medicinsk betydelse 4-7.
Enda molekyl tekniker såsom optisk svällning 8, atomkraftsmikroskopi 9, och magnetiska pincett 10,11 låta forskare att undersöka funktionen hos enzymer på molekylär nivå genom att utöva krafter på enskilda proteiner. Av dessa tekniker, magnetiska pincett (MT) är anmärkningsvärda för sin låga kostnad och hög genomströmning. MT utövar krafter i intervallet ~ 1-100 PN och kan ge millisekund temporal upplösning,kvaliteter som är väl anpassade till att studera enzym-mekanism på en enda molekyl nivå 12. Här rapporterar vi en mycket parallelliserbart MT-analys för att studera effekten av kraft på proteolys av enstaka proteinmolekyler. Vi presenterar det särskilda exemplet av proteolys av en trimer kollagen peptid av matrismetalloproteinasaktivitet 1 (MMP-1), men kan denna analys kan enkelt anpassas för att studera andra substrat och proteaser.
Protocol
Discussion
Detta protokoll beskriver en ny användning för en klassisk enda molekyl teknik. Magnetiska pincett kan medelhög till hög kapacitet enda molekyl analyser i ett kostnadseffektivt sätt. Men liksom alla experimentella tekniker det finns utmaningar och potentiella fallgropar.
Begränsningar av magnetiska pincetter
Jämfört med en optisk fälla den rumsliga och tidsmässiga upplösningen av en MT anordning är låg. Vidare är de krafter som genereras av den enkla M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Burroughs Wellcome Karriär Award på den vetenskapliga Interface (ARD), National Institutes of Health genom NIH direktörens Nya Innovatör Award Program 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Graduate Fellowship (ASA ) och Stanfords Kardiovaskulär Institute dy Predoctoral Fellowship (JC). Författarna tackar James Spudich för att låna ut mikroskopi utrustning.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Riferimenti
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
