Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri
Summary
Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.
Abstract
Mekanik güçlerin üretme ve algılama kanser metastazı 1, aterogenez 2 ve 3 yara iyileşmesi ile doğrudan ilgili olan, hücre fizyolojisi her yerde görülen bir yönüdür. Bu örneklerin her birinde, hücreler çevreleri üzerinde kuvvet uygularlar ve aynı enzimatik remodel ekstraselüler matriks (ECM) hem de. ECM kuvvetlerin etkisi böylece 4-7 büyük olasılıkla onun biyolojik ve tıbbi önemi nedeniyle önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir.
Gibi optik tuzaklama 8, atomik kuvvet mikroskobu 9, ve manyetik cımbız 10,11 olarak tek bir molekülün teknikleri araştırmacılar bireysel proteinler üzerinde kuvvetleri uygulayarak moleküler düzeyde enzim fonksiyonu soruşturma için izin. Bu tekniklerin, manyetik cımbız (MT) Düşük maliyet ve yüksek verimlilik için dikkat çekicidir. MT ~ 1-100 pN aralığında kuvvetleri uygulamak ve milisaniye zamansal çözünürlük sağlayabilir,ayrıca tek moleküllü seviyesi 12 az enzim mekanizmasının çalışma eşleştirilir nitelikleri. Burada tek bir protein moleküllerinin proteoliz tarihinde yürürlüğe etkisini incelemek için son derece parallelizable MT tahlil raporu. Bu matris metalloproteinaz 1 (MMP-1) tarafından bir trimeric kolajen peptid proteolizin spesifik bir örnek sunmak; Bununla birlikte, bu tahlilde kolayca diğer substratlar ve proteazlar incelemek için adapte edilebilir.
Protocol
Discussion
Bu protokol, klasik bir tek bir molekül tekniği için yeni bir kullanımını açıklar. Manyetik cımbız, bir maliyet-etkin şekilde yüksek verimli tek bir molekül testleri orta sağlar. Ancak, tüm deneysel teknikler gibi zorluklar ve potansiyel tuzaklar vardır.
Manyetik cımbız Sınırlamalar
Optik bir tuzak ile karşılaştırıldığında MT aygıtının mekansal ve zamansal çözünürlüğü düşük. Bundan başka, burada açıklanan basit MT tarafın…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Bilimsel Arabirimi (ARD), NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Yüksek Lisans Bursu (ASA de Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklenmiştir ) ve Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü Younger predoctoral Bursu (JC). Yazarlar mikroskopi ekipman loaning James Spudich teşekkür ederim.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×22) | VWR | 48366-067 |
| Micro Cover Glass #1.5 (22×40) | VWR | 48393-048 |
| Lambda DNA | Invitrogen | 25250-010 |
| T4 DNA Ligase | Invitrogen | 15224-041 |
| Microcon Ultracel YM-100 | Millipore | 42413 |
| Anti-Digoxigenin | Roche Diagnostics | 11-333-089-001 |
| Tween 20 | Sigma | P9416-100ML |
| Anti-myc Antibody | Invitrogen | 46-0603 |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | B4287-5G |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| Dynabeads MyOne T1 Streptavidin | Invitrogen | 658.01D |
| p-Aminophenylmercuric Acetate | Calbiochem | 164610 |
| Biotin-Maleimide | Sigma Aldrich | B1267 |
| Biotin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Digoxigenin labeled oligo | IDT DNA | Custom synthesis |
| Collagen peptide gene | DNA 2.0 | Custom synthesis |
| MMP-1 cDNA | Harvard Plasmid Database | |
| z-translator | Thorlabs | MTS50 |
| Servo controller for translator | Thorlabs | TDC001 |
Riferimenti
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).
- Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. Fibrin structure and wound healing. J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).
- Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1. J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).
- Zareian, R. Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir. 26, (2010).
- Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation. Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).
- Jesudason, R. Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin. Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction. Micron. 38, 446-461 (2007).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).
- Frank, S. Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering. J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).
- Stetefeld, J. Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon. Structure. 11, 339-346 (2003).
- Chung, L. Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).
- Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-molecule techniques: a laboratory manual. , (2008).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22, 292-299 (2006).
- Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers. Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).
- Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor. Science. 324, 1330-1334 (2009).
- Woodside, M. T. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).
- del Rio, A. Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding. Science. 323, 638-641 (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).
