Trapianto di cellule staminali in un In vitro Simulato ischemia / riperfusione Modello

Summary

Dimostriamo come impostare uno<em> In vitro</em> Ischemia / riperfusione modello e come valutare l'effetto della terapia con cellule staminali su postischemica cellule cardiache.

Abstract

Protocolli di trapianto di cellule staminali stanno trovando la loro strada nella pratica clinica ^1,2,3. Ottenere risultati migliori, rendendo i protocolli più robusto, e di trovare nuove fonti di cellule impiantabili sono al centro di recenti ricerche ^4,5. Indagare l'efficacia delle terapie cellulari non è un compito facile e nuovi strumenti sono necessari per indagare i meccanismi coinvolti nel processo di trattamento ^6. Abbiamo progettato un protocollo sperimentale di ischemia / riperfusione in modo da consentire l'osservazione di connessioni cellulari e dei meccanismi subcellulari anche durante l'ischemia / riperfusione e dopo il trapianto di cellule staminali e per valutare l'efficacia della terapia cellulare. H9c2 cellule cardiomyoblast sono stati collocati su piastre di coltura cellulare ^7,8. Ischemia è stato simulato con 150 minuti in media glucosio libero con il livello di ossigeno inferiore allo 0,5%. Poi, i media normale e livelli di ossigeno sono state reintrodotte per simulare riperfusione. Dopo la deprivazione di ossigeno glucosio,le cellule danneggiate sono state trattate con il trapianto di midollo osseo umano etichettato cellule staminali mesenchimali aggiungendoli alla cultura. Cellule staminali mesenchimali sono preferiti negli studi clinici, perché sono facilmente accessibili con chirurgia mini-invasiva, facilmente espandibile e autologhe. Dopo 24 ore di co-coltura, le cellule sono state colorate con calceina e etidio-omodimero di distinguere tra cellule vive e morte. Questa configurazione ci ha permesso di indagare le connessioni intercellulari utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza e di quantificare il tasso di sopravvivenza delle cellule postischemica mediante citometria di flusso. Microscopia confocale hanno mostrato le interazioni delle due popolazioni cellulari, come la fusione cellulare e la formazione di nanotubi intercellulari. Analisi di citometria a flusso ha rivelato 3 gruppi di cellule danneggiate, che può essere tracciata su un grafico e analizzati statisticamente. Queste popolazioni possono essere indagati separatamente e si possono trarre conclusioni su questi dati sull'efficacia del simulatoapproccio terapeutico.

Protocol

1. Preparazione H9c2 cellule cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts ratto sono stati ottenuti da ATCC (Wesel, Germania) e ampliato nel glucosio (4,5 g / L) DMEM contenente 10% di siero fetale bovino, 4 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. La linea cellulare H9c2 mioblasti è derivato da cuore di ratto embrionale, è usato come un modello in vitro sia per muscolo scheletrico e cardiaco 8,9. Preparare 12 pozzetti di H9c2 …

Discussion

Il protocollo è dimostrato un approccio in vitro alla questione molto più complessa di terapia con cellule staminali in infarto miocardico, con tutti i vantaggi e gli svantaggi di un tale modello. Ovviamente non può riflettere il complesso (ad esempio, immunologici) eventi che si svolgeranno durante e dopo l'infarto del miocardio, ma può concentrarsi sugli effetti diretti delle cellule aggiunto sulle cellule postischemica. Gli effetti di ischemia simulata su H9c2 cardiomyoblasts molto dipende dal tempo di OGD, s…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
calcein-AM	Molecular Probes	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
ethidium homodimer-2	Molecular Probes	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD	Molecular Probes	V22887	http://www.invitrogen.com

Table 1. Reagents.

Name of the equipment	Company	Comments (optional)
PeCon cell incubation system for Zeiss microscopes	PeCon GmbH	www.pecon.biz/

Table 2. Equipment.