Stamcelletransplantation i en In vitro Simuleret Iskæmi / reperfusion Model

Summary

Vi viser, hvordan du opretter en<em> In vitro</em> Iskæmi / reperfusion model og hvordan man kan vurdere effekten af ​​stamcellebehandling på postischemic hjerteceller.

Abstract

Stamcelletransplantation protokoller er at finde deres vej ind i klinisk praksis ^1,2,3. Kom i bedre resultater, hvilket gør de protokoller mere robust, og finde nye kilder til implantable celler er i fokus i nyere forskning ^4,5. Undersøgelse af effektiviteten af celleterapier er ikke en let opgave, og nye værktøjer er nødvendige for at undersøge de mekanismer, der er involveret i behandlingsprocessen ^6. Vi har designet en forsøgsprotokol af iskæmi / reperfusion for at tillade observation af cellulære forbindelser og endda subcellulære mekanismer under iskæmi / reperfusion skade og efter stamcelletransplantation, og at evaluere effekten af ​​celleterapi. H9c2 cardiomyoblast celler blev placeret på cellekultur plader ^7,8. Iskæmi blev simuleret med 150 minutter i en glukose frit medie med ilt niveau under 0,5%. Derefter var normale medier og ilt niveauer genindført at simulere reperfusion. Efter ilt glukose afsavn,de beskadigede celler blev behandlet med transplantation af mærket menneskelige knoglemarv afledt mesenchymale stamceller ved at tilføje dem til kulturen. Mesenchymale stamceller er foretrukket i kliniske forsøg, fordi de er let tilgængelige med minimal invasiv kirurgi, nemt kan udvides og autolog. Efter 24 timers co-dyrkning, blev cellerne farvet med calcein og ethidium-homodimer at skelne mellem levende og døde celler. Denne opsætning gav os mulighed for at undersøge intercellulære forbindelser ved hjælp af konfokal fluorescens mikroskopi og at kvantificere overlevelsesraten for postischemic celler ved flowcytometri. Konfokal mikroskopi viste samspillet mellem de to cellepopulationer såsom celle fusion og dannelsen af ​​intercellulære nanorør. Flowcytometri analyse viste 3 klynger af beskadigede celler, som kan plottes på en graf og analyseret statistisk. Disse befolkninger kan undersøges separat og konklusioner, der kan trækkes på disse data om effektiviteten af ​​den simuleredeterapeutiske tilgang.

Protocol

1. Forberedelse H9c2 cardiomyoblast celler H9c2 rotte cardiomyoblasts blev indhentet fra ATCC (Wesel, Tyskland) og udvidet i høj glukose (4,5 g / L) DMEM med 10% føtalt bovint serum, 4 mM L-glutamin, 100 E / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin. Den H9c2 myoblast cellelinje er afledt af embryonale rotte hjertet, er det brugt som en in vitro model for både skelet-og hjertemuskulaturen 8,9. Forbered 12 brønds plade af H9c2 celler: Fje…

Discussion

Det viste protokollen er en in vitro tilgang til det langt mere komplekse spørgsmål om stamcelleterapi i myokardieinfarkt, med alle de fordele og ulemper ved en sådan model. Naturligvis kan den ikke afspejler den komplekse (fx immunologiske) begivenheder, der finder sted under og efter myokardieinfarkt, men kan fokusere på de direkte effekter af den tilførte celler på postischemic celler. Virkningerne af simulerede iskæmi på H9c2 cardiomyoblasts meget afhænger af tidspunktet for OGD, om overgangen antallet af d…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
calcein-AM	Molecular Probes	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
ethidium homodimer-2	Molecular Probes	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD	Molecular Probes	V22887	http://www.invitrogen.com

Table 1. Reagents.

Name of the equipment	Company	Comments (optional)
PeCon cell incubation system for Zeiss microscopes	PeCon GmbH	www.pecon.biz/

Table 2. Equipment.