Stamceltransplantatie in een In vitro Gesimuleerde ischemie / reperfusie model
Summary
Laten we zien hoe het opzetten van een<em> In vitro</em> Ischemie / reperfusie model en hoe het effect van de stamceltherapie op postischemic cardiale cellen te evalueren.
Abstract
Stamceltransplantatie protocollen vinden hun weg naar de klinische praktijk 1,2,3. Beter resultaat, waardoor de protocollen robuuster, en het vinden van nieuwe bronnen voor de implanteerbare cellen zijn de focus van recent onderzoek 4,5. Onderzoek naar de effectiviteit van de cel therapieën is niet een gemakkelijke taak en zijn nieuwe instrumenten nodig om de mechanismen betrokken bij het behandelingsproces zes onderzoeken. We ontwierpen een experimenteel protocol van ischemie / reperfusie in om het observeren van cellulaire verbindingen en zelfs subcellulaire mechanismen tijdens ischemie / reperfusie schade en na stamceltransplantatie mogelijk te maken en de effectiviteit van celtherapie te evalueren. H9c2 cardiomyoblast cellen werden geplaatst op celcultuur platen 7,8. Ischemie werd gesimuleerd met 150 minuten in een glucose-vrij medium met zuurstof niveau lager dan 0,5%. Daarna werden de normale media en zuurstof niveaus opnieuw naar reperfusie te simuleren. Na zuurstof glucose ontbering,de beschadigde cellen werden behandeld met de transplantatie van gelabelde menselijke beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen toe te voegen aan de cultuur. Mesenchymale stamcellen de voorkeur in klinische studies, omdat ze gemakkelijk te bereiken met minimaal invasieve chirurgie, gemakkelijk uitbreidbaar en autologe. Na 24 uur co-teelt, werden cellen gekleurd met calceïne en ethidium-homodimeer onderscheid te maken tussen levende en dode cellen. Deze opzet liet ons toe om de intercellulaire verbindingen met behulp van confocale fluorescentie microscopie te onderzoeken en om de overleving van postischemic cellen door flowcytometrie kwantificeren. Confocale microscopie toonde de interacties van de twee celpopulaties zoals celfusie en de vorming van intercellulaire nanobuisjes. Flowcytometrie analyse bleek drie clusters van beschadigde cellen die kunnen worden uitgezet in een grafiek en statistisch geanalyseerd. Deze populatie kunnen afzonderlijk worden onderzocht en conclusies kunnen worden getrokken over deze gegevens over de effectiviteit van de gesimuleerdetherapeutische aanpak.
Protocol
Discussion
De aangetoonde protocol is een in vitro benadering van de veel meer complexe kwestie van stamceltherapie in myocard infarct, met alle voordelen en nadelen van een dergelijk model. Uiteraard kan het geen afspiegeling van het complex (bijvoorbeeld immunologische) evenementen die plaatsvinden tijdens en na het hartinfarct, maar kan zich richten op de directe effecten van de toegevoegde cellen op het postischemic cellen. De effecten van gesimuleerde ischemie op H9c2 cardiomyoblasts sterk afhankelijk van het tijdstip van OGD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door OTKA (Hongaarse Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek) D45933, T049621, TET (Hongaarse Science and Technology Foundation) A4/04, Arg-17/2006 en SIN, Bolyai, Öveges Fellowships en TÁMOP 4.2.2-08 / 1 / KMR-2008-0004 en 4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001. OTKA 83.803. We willen graag William Gesztes bedanken voor het verstrekken van de voice-over.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| calcein-AM | Molecular Probes | L3224, C3099 | http://www.invitrogen.com |
| ethidium homodimer-2 | Molecular Probes | L3224, E3599 | http://www.invitrogen.com |
| Vybrant DiD | Molecular Probes | V22887 | http://www.invitrogen.com |
Table 1. Reagents.
| Name of the equipment | Company | Comments (optional) |
| PeCon cell incubation system for Zeiss microscopes | PeCon GmbH | www.pecon.biz/ |
Table 2. Equipment.
Riferimenti
- Dimmeler, S., Burchfield, J., Zeiher, A. M. Cell-Based Therapy of Myocardial Infarction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28, (2008).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: A review. Journal of Neuroscience Research. 87, 2183-21 (2009).
- Lee, K., Chan, C. K., Patil, N., Goodman, S. B. Cell therapy for bone regeneration-Bench to bedside. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 89, 252-25 (2009).
- Gaipa, G. GMP-based CD133+ cells isolation maintains progenitor angiogenic properties and enhances standardization in cardiovascular cell therapy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1619-1619 (2010).
- Trounson, A. New perspectives in human stem cell therapeutic research. BMC medicine. 7, 29-29 (2009).
- Mazhari, R., Hare, J. M. Mechanisms of action of mesenchymal stem cells in cardiac repair: potential influences on the cardiac stem cell niche. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, S21-S21 (2007).
- Kimes, B. W., Brandt, B. L. Properties of a clonal muscle cell line from rat heart. Experimental Cell Research. 98, 367-367 (1976).
- Sardao, V. A. Vital imaging of H9c2 myoblasts exposed to tert-butylhydroperoxide–characterization of morphological features of cell death. BMC Cell Biol. 8, 11-11 (2007).
- Hescheler, J. Morphological, biochemical, and electrophysiological characterization of a clonal cell (H9c2) line from rat heart. Circulation research. 69, 1476-1476 (1991).
- Cselenyak, A. Mesenchymal stem cells rescue cardiomyoblasts from cell death in an in vitro ischemia model via direct cell-to-cell connections. BMC Cell Biol. 11, 29-29 (2010).
- Sauvant, C. Implementation of an in vitro model system for investigation of reperfusion damage after renal ischemia. Cell Physiol Biochem. 24, 567-567 (2009).
- Namas, R. A. Hypoxia-Induced Overexpression of BNIP3 is Not Dependent on Hypoxia-Inducible Factor 1alpha in Mouse Hepatocytes. Shock. 36, 196-196 (2011).
- Cao, L. Hypoxia/Reoxygenation Up-Regulated the Expression of Death Receptor 5 and Enhanced Apoptosis in Human Hepatocyte Line. Transplantation Proceedings. 38, 2207-2207 (2006).
- Meloni, B. P., Meade, A. J., Kitikomolsuk, D., Knuckey, N. W. Characterisation of neuronal cell death in acute and delayed in vitro ischemia (oxygen-glucose deprivation) models. Journal of Neuroscience Methods. 195, 67-67 (2011).
- Mimeault, M., Hauke, R., Batra, S. K. Stem cells: a revolution in therapeutics–recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative medicine and cancer therapies. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 82, 252-252 (2007).
- Angoulvant, D. Mesenchymal stem cell conditioned media attenuates in vitro and ex vivo myocardial reperfusion injury. J Heart Lung Transplant. 30, 95-95 (2010).
- Lim, Y. J., Zheng, S., Zuo, Z. Morphine Preconditions Purkinje Cells against Cell Death under In Vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Conditions. Anesthesiology. 100, 562-562 (2004).
- Guo, J. Estrogen-receptor-mediated protection of cerebral endothelial cell viability and mitochondrial function after ischemic insult in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 30, 545-545 (2010).
