Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d'ischémie / reperfusion modèle

Summary

Nous démontrons comment mettre en place une<em> In vitro</em> Ischémie / reperfusion modèle et la façon d'évaluer l'effet du traitement sur les cellules souches des cellules cardiaques post-ischémique.

Abstract

Protocoles greffe de cellules souches trouvent leur chemin dans la pratique clinique ^1,2,3. Obtenir de meilleurs résultats, ce qui rend les protocoles plus robustes, et de trouver de nouvelles sources de cellules implantables font l'objet de recherches récentes ^4,5. Étude de l'efficacité des thérapies cellulaires n'est pas une tâche facile et de nouveaux outils sont nécessaires pour étudier les mécanismes impliqués dans le processus ^de traitement ^6. Nous avons conçu un protocole expérimental d'ischémie / reperfusion en vue de permettre l'observation des connexions cellulaires et des mécanismes subcellulaires même durant l'ischémie / reperfusion et après la transplantation de cellules souches et d'évaluer l'efficacité de la thérapie cellulaire. H9c2 cellules cardiomyoblast ont été placés sur des plaques de culture cellulaire ^7,8. L'ischémie a été simulé avec 150 minutes dans un milieu glucose libre avec le niveau d'oxygène inférieur à 0,5%. Ensuite, les médias normaux et les niveaux d'oxygène ont été réintroduits afin de simuler la reperfusion. Après privation de glucose d'oxygène,les cellules endommagées ont été traités avec la transplantation de moelle osseuse humaine marquée dérivées des cellules souches mésenchymateuses en les ajoutant à la culture. Les cellules souches mésenchymateuses sont préférés dans les essais cliniques, car ils sont facilement accessibles grâce à la chirurgie invasive minimale, facilement extensible et autologues. Après 24 heures de co-culture, les cellules ont été colorées avec calcéine et éthidium homodimère-à différencier entre les cellules vivantes et mortes. Cette configuration nous a permis d'étudier les connexions intercellulaires utilisant microscopie confocale à fluorescence et de quantifier le taux de survie des cellules post-ischémique par cytométrie en flux. La microscopie confocale a montré les interactions entre les deux populations cellulaires telles que la fusion cellulaire et la formation des nanotubes intercellulaires. L'analyse par cytométrie en flux a révélé trois groupes de cellules endommagées qui peuvent être reportés sur un graphique et analysées statistiquement. Ces populations peuvent être étudiés séparément et conclusions peuvent être tirées de ces données sur l'efficacité de la simulationapproche thérapeutique.

Protocol

1. Préparation H9c2 cellules cardiomyoblast H9c2 cardiomyoblasts rat ont été obtenus auprès de l'ATCC (Wesel, Allemagne) et élargi en glucose (4,5 g / L) DMEM contenant 10% de sérum fœtal bovin, 4 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. La ligne de cellules myoblastes H9c2 est dérivé de coeur de rat embryonnaire, il est utilisé comme un modèle in vitro pour les deux muscles squelettiques et cardiaques 8,9. <p class="jove_cont…

Discussion

Le protocole a démontré une approche in vitro à la question beaucoup plus complexe de la thérapie de cellules souches dans l'infarctus du myocarde, avec tous les avantages et les inconvénients d'un tel modèle. Évidemment, il ne peut pas refléter la complexité (immunologiques, par exemple) des événements qui ont lieu pendant et après l'infarctus du myocarde, mais peuvent se concentrer sur les effets directs des cellules ajoutés sur les cellules post-ischémique. Les effets de l'ischémie simu…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
calcein-AM	Molecular Probes	L3224, C3099	http://www.invitrogen.com
ethidium homodimer-2	Molecular Probes	L3224, E3599	http://www.invitrogen.com
Vybrant DiD	Molecular Probes	V22887	http://www.invitrogen.com

Table 1. Reagents.

Name of the equipment	Company	Comments (optional)
PeCon cell incubation system for Zeiss microscopes	PeCon GmbH	www.pecon.biz/

Table 2. Equipment.