التحليل الكمي للهجرة عشوائية من الخلايا باستخدام الوقت الفاصل بين الميكروسكوب فيديو
Summary
هذا الأسلوب يسمح للرصد من الخلايا في الوقت الحقيقي، والقياسات الكمية من مختلف المعلمات هجرة الخلية مثل السرعة، والتشريد، والسرعة. وعلى عكس الطرق التقليدية، لا يستند هذا النهج في الوقت الحقيقي على قياسات نقطة النهاية الهجرة كمي وبدلا من ذلك لأنها تتيح مراقبة وحساب معايير مختلفة بشكل مستمر.
Abstract
هجرة الخلية هي عملية دينامية، وهو أمر مهم لنمو الجنين، وإصلاح الأنسجة، وظيفة نظام المناعة، وغزو ورم 1 و 2. أثناء الهجرة اتجاهي، وخلايا التحرك بسرعة استجابة لإشارة الكيميائي خارج الخلية، أو استجابة لمنبهات جوهري 3 التي قدمتها الحركة الآلية الأساسية. الهجرة العشوائية يحدث عندما خلية تمتلك الاتجاهية جوهري منخفض، مما يسمح للخلايا لاستكشاف بيئتهم المحلية.
هجرة الخلية هي عملية معقدة، في الخلية الاستجابة الأولية يخضع الاستقطاب ويمتد نتوءات في اتجاه هجرة 2. الطرق التقليدية لقياس الهجرة مثل الهجرة بويدن غرفة الفحص هو وسيلة سهلة لقياس الكيميائي في المختبر، والتي تسمح بقياس الهجرة باعتبارها النتيجة النهائية نقطة. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يتيح قياس المعلمات الهجرة الفردية، كما أنها لا تسمح لvisualization من تغيرات شكلية تلك الخلية يمر خلال الهجرة.
هنا، نقدم وسيلة تسمح لنا لرصد الخلايا المهاجرة في الوقت الحقيقي باستخدام الفيديو – المجهر وقت مضي. منذ هجرة الخلية والغزو هي السمات المميزة لمرض السرطان، وهذه الطريقة يمكن تطبيقها في دراسة سرطان الخلية الهجرة والغزو في المختبر. وقد اعتبر هجرة عشوائية من الصفائح الدموية واحدة من المعلمات من 4 وظائف الصفائح الدموية، وبالتالي يمكن لهذا الأسلوب يكون من المفيد أيضا في دراسة وظائف الصفائح الدموية. هذا فحص لديها ميزة كونها وموثوقة السريع، واستنساخه، ولا تحتاج إلى الاستغلال الأمثل للأرقام الخلية. من أجل المحافظة على ظروف ملائمة من الناحية الفسيولوجية للخلايا، وقد تم تجهيز المجهر مع العرض 2 أكسيد الكربون والحرارة درجة الحرارة. ويتم رصد حركة الخلايا من قبل التقاط الصور باستخدام كاميرا مزودة للمجهر على فترات منتظمة. ويمكن حساب هجرة الخلية بواسطة قياس متوسط السرعة والنزوح verage، الذي يحسب بواسطة برنامج Slidebook.
Protocol
Discussion
في الوقت الحقيقي فحص الهجرة العشوائية تمكن، حساس دقيق، وتحليل المعلمات هجرة الخلية مثل السرعة والتشريد. لا يقتصر هذا الأسلوب لانهاء نقطة قياس قيمة، وبالتالي فإنه من الكمية. منذ ذلك الحين، ويتم رصد الخلايا في المتوسط DMEM طبيعية مع مصل الدم، فإنه يقلل من التأثير الض…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر أماندا Struckhoff للمساعدة أولية مع هذه التجربة. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد الوطنية للصحة 5RO1CA115706.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
Riferimenti
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
