מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם
Summary
אנחנו מראים את השיטה לביצוע מיקרוסקופיה intravital של הטחול בעזרת ה-GFP טפילי מלריה מהונדס ואת כימות של ניידות טפיל ואת זרימת הדם בתוך איבר זה.
Abstract
הופעתו של מיקרוסקופיה intravital במודלים ניסיוניים מלריה מכרסם אפשרה התקדמות גדולה לידיעת 1,2 אינטראקציות טפיל-המארח. לפיכך, הדמיה vivo של טפילי מלריה במהלך טרום האריתרוציטים בשלבים חשפו את הכניסה הפעילה של טפילים לתוך בלוטות הלימפה לעור 3, התפתחות מלאה של הטפיל בעור 4, ויצירת merosome hepatocyte הנגזרות להבטיח הגירה שחרורו של merozoites לתוך זרם הדם 5. יתר על כן, התפתחות של טפילים בודדים אריתרוציטים תועד לאחרונה באמצעות הדמיה 4D תיגר התצוגה הנוכחית שלנו על יצוא חלבון מלריה 6. לפיכך, הדמיה intravital השתנה באופן קיצוני דעתנו על אירועי מפתח בפיתוח Plasmodium. למרבה הצער, מחקרים המעבר הדינאמי של טפילי מלריה דרך הטחול, איבר הלימפה העיקריים מותאם להפליא כדי לנקות אדום נגוע בתאים lood חסרים בשל אילוצים טכניים.
שימוש במודל Murine של המלריה Plasmodium yoelii ב Balb / c עכברים, יישמנו הדמיה intravital של הטחול ודיווח על שיפוץ ההפרש של אותה דבקות parasitized של כדוריות דם אדומות (pRBCs) לתאי מחסום המוצא fibroblastic עיסת אדום במהלך זיהום עם לא קטלני טפיל קו P.yoelii 17x בניגוד זיהומים עם קו 17XL P.yoelii טפיל קטלני 7. כדי להגיע למסקנות האלה, מתודולוגיה ספציפית באמצעות תוכנת ImageJ בחינם פותחה כדי לאפשר אפיון של התנועה תלת מימדי מהיר של יחיד pRBCs. התוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מאפשר לקבוע, מהירות כיווניות ומגורים זמן של טפילים הטחול, כל הפרמטרים פונה דבקות in vivo. בנוסף, אנו מדווחים על מתודולוגיה כימות זרימת הדם באמצעות מיקרוסקופ intravital ושימוש אונטערשיידferent צביעה סוכני לקבל תובנות לתוך המבנה microcirculatory מורכבת של הטחול.
משפט ואתיקה
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו במתקני חיה של אוניברסיטת ברצלונה בהתאם להנחיות ופרוטוקולים אושרה על ידי ועדת האתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת ברצלונה CEEA-UB (פרוטוקול לא DMAH: 5429). נקבה Balb / c עכברים של 6-8 שבועות של גיל התקבלו צ'ארלס ריבר מעבדות.
Protocol
Discussion
יישום של מיקרוסקופיה intravital של הטחול במודל זה מלריה מכרסם פתחה את האפשרות לחקור את המעבר הדינאמי של טפילים באמצעות איבר זה שעד עתה נחשב "קופסה שחורה" בשל שיקולים טכניים. כאן, מאמץ גדול הושם להתאים שיטה כמותית המאפשרת ניתוח השוואתי של קווי טפיל שונה ברמות יחיד האו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה במיוחד ס Graewe וו 'Heussler לאימונים הראשוני קלט רציף במיקרוסקופ intravital של טפילי מלריה, כדי ג'יי ברנס על תרומת ה-GFP טפילים מהונדס, א' בוש (יחידת Confocal, CCiT-UB, IDIBAPS) סיוע בניתוח תמונה וכימות ועל פ Astola לקבלת סיוע טכני. אנו מודים tous ר Caralt I. עבור הפקת וידאו. MF הוא מקבל מלגת בוגר בכלליות של קטלוניה. הפ הוא פרופסור מחקר ICREA. עבודה במעבדה של הפ ממומנת על ידי תוכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7/2007-2013) מענק לפי הסכם N ° 242095, על ידי קרן פרטית CELLEX (קטלוניה, ספרד), ועל ידי משרד ספרדית למדע וחדשנות ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
Riferimenti
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
