Microscopia intravitale della Milza: analisi quantitativa della mobilità Parasite e del flusso sanguigno
Summary
Mostriamo il metodo per l'esecuzione di microscopia intravitale della milza con GFP parassiti della malaria transgenici e la quantificazione della mobilità parassita e del flusso sanguigno all'interno di questo organo.
Abstract
L'avvento della microscopia intravitale in modelli sperimentali malaria roditore ha permesso importanti progressi alla conoscenza del parassita-ospite 1,2 interazioni. Così, di imaging in vivo di parassiti della malaria durante la pre-eritrocitaria fasi hanno portato alla luce l'ingresso attivo di parassiti nei linfonodi pelle 3, il completo sviluppo del parassita nella pelle 4, e la formazione di un derivato degli epatociti merosome per assicurare la migrazione e rilascio di merozoiti nel flusso sanguigno 5. Inoltre, lo sviluppo di parassiti singoli negli eritrociti è stata recentemente documentata mediante imaging 4D e ha sfidato la nostra visione attuale in materia di esportazione delle proteine della malaria 6. Così, l'imaging intravitale ha radicalmente cambiato la nostra visione sugli eventi chiave nello sviluppo Plasmodium. Purtroppo, gli studi del passaggio dinamico di parassiti della malaria attraverso la milza, un organo importante linfoide squisitamente adattate per cancellare infetti rosso blood cellule sono carenti a causa di vincoli tecnici.
Utilizzando il modello murino della malaria da Plasmodium yoelii in topi BALB / c, abbiamo implementato l'imaging intravitale della milza e ha riportato un rimodellamento differenziale di essa e l'aderenza dei globuli rossi parassitati (pRBCs) alle cellule barriera di origine fibroblastica nella polpa rosso durante infezione con il non-letale parassita linea P.yoelii 17X rispetto alle infezioni con la linea 17XL P.yoelii letale parassita 7. Per arrivare a queste conclusioni, una metodologia specifica con ImageJ software libero è stato sviluppato per consentire la caratterizzazione del veloce movimento tridimensionale del singolo pRBCs. I risultati ottenuti con questo protocollo consentono di determinare il tempo della velocità, direzionalità e di soggiorno dei parassiti nella milza, tutti i parametri di indirizzamento aderenza in vivo. Inoltre, riportiamo la metodologia per quantificare il flusso di sangue al microscopio intravitale e l'uso di DIFferent coloranti al fine di conoscere la struttura complessa del microcircolo della milza.
Dichiarazione etica
Tutti gli studi su animali sono stati effettuati presso le strutture animale dell'Università di Barcellona, in conformità alle linee guida e protocolli approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Università di Barcellona CEEA-UB (protocollo n. DMAH: 5429). Femmina Balb / c topi di 6-8 settimane di età sono stati ottenuti da Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
L'attuazione di microscopia intravitale della milza in questo modello la malaria roditore ha aperto la possibilità di indagare il passaggio dinamica dei parassiti attraverso questo organo che fino ad ora è stato considerato un "black-box" a causa di considerazioni tecniche. Qui, un grande sforzo è stato messo per adattare un metodo quantitativo che permette l'analisi comparativa delle diverse linee di parassiti a livello singolo e della popolazione. A differenza di altri tessuti e cellule, che era s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo particolarmente grati a S. Graewe e V. Heussler per la formazione iniziale e continua di ingresso in microscopia intravitale di parassiti della malaria, a J. Burns per la donazione GFP parassiti transgenici, ad A. Bosch (Unità confocale, CCIT-UB, IDIBAPS) per l'assistenza in analisi di immagini e quantificazione e di P. Astola per assistenza tecnica. Ringraziamo Tous R. e Caralt I. per la produzione video. MF è un destinatario di una borsa di studio laureati dal Generalità della Catalogna. HAP è un professore di ricerca ICREA. Il lavoro nel laboratorio di HAP è finanziato dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) sotto della convenzione di sovvenzione n. 242095, dalla Fondazione Privata CELLEX (Catalogna, Spagna), e dal Ministero spagnolo della Scienza e dell'Innovazione ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
Riferimenti
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