Microscopia intravital del bazo: Análisis cuantitativo de la movilidad del parásito y el flujo sanguíneo
Summary
Se muestra el método para realizar microscopía intravital del bazo con las buenas prácticas agrarias parásitos de la malaria transgénicos y la cuantificación de la movilidad del parásito y el flujo de sangre dentro de este órgano.
Abstract
El advenimiento de la microscopía intravital en modelos experimentales de roedores malaria ha permitido grandes avances en el conocimiento de 1,2 interacciones parásito-hospedador. Por lo tanto, de imágenes in vivo de parásitos de la malaria durante el pre-eritrocítica etapas han puesto de manifiesto la entrada activa de los parásitos en los ganglios linfáticos de piel 3, el desarrollo completo del parásito en la piel 4, y la formación de un merosoma hepatocitos derivados para asegurar la migración y liberación de merozoítos en el torrente sanguíneo 5. Por otra parte, el desarrollo de parásitos individuales en los eritrocitos se ha documentado recientemente con imágenes 4D y desafió a nuestra visión actual de la exportación de proteínas de la malaria 6. Por lo tanto, la imagen intravital ha cambiado radicalmente nuestra visión sobre los acontecimientos clave en el desarrollo de Plasmodium. Desafortunadamente, los estudios del paso dinámico de parásitos de la malaria a través del bazo, un órgano linfoide importante exquisitamente adaptados para borrar rojos infectados bcélulas lood faltan debido a limitaciones técnicas.
Utilizando el modelo murino de la malaria Plasmodium yoelii en ratones Balb / c, hemos puesto en marcha imágenes intravital del bazo e informó de una remodelación diferencial de la misma y la adherencia de los glóbulos rojos parasitados (pRBCs) a las células de la barrera de origen fibroblástico en la pulpa roja durante la infección con el parásito no letales línea P.yoelii 17X en lugar de las infecciones con el P.yoelii línea 17XL letal parásito 7. Para llegar a estas conclusiones, una metodología específica con ImageJ software libre fue desarrollado para permitir la caracterización de la velocidad en tres dimensiones el movimiento de un solo pRBCs. Los resultados obtenidos con este protocolo permite determinar el tiempo de la velocidad, la direccionalidad y la residencia de los parásitos en el bazo, todos los parámetros de abordar la adherencia en vivo. Además, se presenta la metodología para la cuantificación del flujo sanguíneo mediante microscopía intravital y el uso de DIFdiferentes colorantes para comprender mejor la estructura del complejo de la microcirculación del bazo.
Ética declaración
Todos los estudios con animales se realizaron en las instalaciones de animales de la Universidad de Barcelona, de acuerdo con las directrices y los protocolos aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Barcelona UB-CEEA (Protocolo n º DMAH: 5429). Mujer ratones Balb / c de 6-8 semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
La aplicación de la microscopía intravital del bazo en este modelo la malaria roedores abrió la posibilidad de investigar el paso dinámico de los parásitos a través de este órgano, que hasta ahora ha sido considerado un "recuadro negro", debido a consideraciones técnicas. Aquí, un gran esfuerzo se puso a adaptar un método cuantitativo que permite el análisis comparativo de las líneas de parásito diferente en los niveles individual y poblacional. En contraste con otros tejidos y células que había…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos especialmente agradecidos a S. Graewe y Heussler V. para la formación inicial y continua de entrada en la microscopía intravital de parásitos de la malaria, a J. Burns para la donación de las buenas prácticas agrarias parásitos transgénicos, A. Bosch (Unidad de Confocal, CCIT-UB, IDIBAPS) de asistencia en el análisis de imágenes y la cuantificación y P. Astola de asistencia técnica. Damos las gracias a R. Tous y Caralt I. para la producción de video. MF es un beneficiario de una beca de postgrado de la Generalidad de Cataluña. HAP es un profesor de investigación ICREA. Trabajo en el laboratorio de HAP es financiado por el Programa de la Comunidad Europea Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención N ° 242095, por la privada Fundación Cellex (Cataluña, España), y por el Ministerio español de Ciencia e Innovación ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
Riferimenti
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