Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Model organizma<em> C. elegans</em> Pasif bir dolaşım sistemi olarak pseudocoelomic sıvısı kullanır. Bu sıvı Doğrudan testi daha önce mümkün olmamıştır. Burada doğrudan tahlil ekstrasellüler boşluğa bir roman tekniği sunmak ve ilke örnek bir kanıtı olarak RNAi yanıtı sırasında sistemik susturulması sinyalleri kullanır.
Abstract
Genetik uysal model organizma C. elegans büyüme ve küçük boyutu kolaylığı, kısa döl süresi olarak etkin, biyolojik soruları sayısız içgörüler sağladı. Bu küçük boyutlu olsa da, diğer model sistemlerde bulunan teknik yaklaşımlar bir dizi izin vermemesi. Örneğin, memeli sistemlerinde ve bitkilerde aşılama teknikleri, kan transfüzyonları dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon sorular sorarak etkinleştirdiğinizde. Son zamanlarda doğrudan test edilmesi imkansız kadar solucanın dolaşım sistemi, pseudocoelom vardır. Hücrelerarası sinyalizasyon ve dolaşım sistemi kompozisyon C. soruları cevaplamak için elegans araştırmacılar geleneksel genetik analiz, hücre / doku spesifik kurtarma ve mozaik analizi döndü. Bu teknikler hücreler arasında ne olup bittiğini anlaması için bir araç sağlar, ancak ekstrasellüler moleküllerin tanımlanması ve karakterizasyonu evrensel olarak geçerli değildir. Burada biz ne sunuyoruzdoğrudan tahlil C. pseudocoelomic sıvı WLY geliştirilmiş tekniği elegans. Tekniği ekstraselüler sıvı hacmini artırmak için genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Daha sonra hayvanların ince bir denge basıncı kontrolü sağlayan bir mikroenjeksiyon kulesi kullanarak bir vampir ters mikroenjeksiyon tekniği tabi tutulur. Ekstrasellüler sıvı izolasyonundan sonra, toplanan sıvı diğer hayvanların içine transferi ile ya da moleküler araçlar ile tayin edilebilir. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için bir sistemik RNAi yanıtı sırasında tahlil ekstraselüler sinyal molekülleri, uzun dsRNA belirli bir örnek için ayrıntılı bir yaklaşım sunmak. Sistemik RNAi karakterizasyonu prensibi örnek bir kanıtı olsa da, biz dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon soruları çeşitli cevaplamak için adapte olarak bu tekniği görmek.
Protocol
Discussion
Biz burada model organizma C'den ekstrasellüler sıvı izolasyonu ve karakterizasyonu sağlayan yeni bir yöntem sundu elegans. Tekniği ekstrasellüler sıvı toplam hacmi artırmak için donör solucanlar genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Hücre dışı sıvı daha sonra bir modifiye mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak izole edilir. Solucanlar işlem sırasında halen solucanlar tutmak için kuru agaroz pedleri kullanarak mikroenjeksiyon için monte edilmiştir. Pad fiziksel ek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Hunter laboratuar işbirlikçi doğasını kabul etmek ister ve bu tekniğin geliştirilmesi mümkün ve eğlenceli hale faydalı tartışma ve yardım için kendilerine teşekkür ederim. Biz Nigel Delaney ve solucan ve bakteriyel suşları için Caenorhabditis Genetik Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri CPH GM089795 hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Day | Worm Prep | Material Prep |
| -7 or prior | Maintain clean, well fed clr-1(e1745) and N2 worms | Make injection pads, NGM plates, NGM +Carb/IPTG plates, OP50 LB stock |
| -6 | Streak out RNAi food on LB + Carb | |
| -5 | Inoculate 3 mL overnight with RNAi food | |
| -4 | Move embryos to RNAi plate | Seed RNAi plate |
| -3 | ||
| -2 | ||
| -1 | ||
| 0 | Shift worms to 25 for 4 hours | Make assay plates |
| Move worms to clean NGM plates | ||
| Vampiric transfer | ||
| Recover recipient | ||
| +1 | Remove transfer recipient | |
| +2 | Score Progeny |
Table 1. Material preparation timeline.
| Equipment | Company | Catalogue number |
| Picoliter Pressure Injector | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming/Brown micropipette Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reagents | ||
| Mineral Oil | EM Science | MX1560-1 |
| 22×50 no 1½ Cover Glass | Corning | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precisions Instruments | 1B100F-4 |
| Sodium Hypochlorite Solution (5% available Chlorine) | J.T. Baker | 9416-01 |
| C. elegans and Bacterial Strains | ||
| clr-1(e1745)II 9 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB3241 |
| glp-1 RNAi vector 10 | Source Bioscience (Ahringer Feeding Library) | F02A9.6 |
| pal-1 RNAi vector11 | pHC187 | |
| OP50-GFP 5 | The Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP | |
Table 2. Specific reagents and equipment.
Riferimenti
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 controls body size and lifespan in C elegans. Development. 130, 1089-1099 (2003).
- Kimble, J. Alterations in cell lineage following laser ablation of cells in the somatic gonad of Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 87, 286-300 (1981).
- Hegreness, M., Shoresh, N., Hartl, D., Kishony, R. An equivalence principle for the incorporation of favorable mutations in asexual populations. Science. 311, 1615-1617 (2006).
- Labrousse, A., Chauvet, S., Couillault, C., Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans is a model host for Salmonella typhimurium. Curr. Biol. 10, 1543-1545 (2000).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome. Biol. 2, (2001).
- Min, K., Kang, J., Lee, J. A modified feeding RNAi method for simultaneous knock-down of more than one gene in Caenorhabditis elegans. Biotechniques. 48, 229-232 (2010).
- Zhuang, J. J., Hunter, C. P. Tissue-specificity of Caenorhabditis elegans Enhanced RNAi Mutants. Genetica. 188 (1), 235-237 (2011).
- Way, J. C., Chalfie, M. mec-3, a homeobox-containing gene that specifies differentiation of the touch receptor neurons in C. elegans. Cell. 54, 5-16 (1988).
- Kamath, R. S., Fraser, A. G., Dong, Y., Poulin, G., Durbin, R., Gotta, M., Kanapin, A., Bot, N. L. e., Moreno, S., Sohrmann, M. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Winston, W. M., Molodowitch, C., Hunter, C. P. Systemic RNAi in C. elegans requires the putative transmembrane protein SID-1. Science. 295, 2456-2459 (2002).
