Данио рерио представляет собой ценную модель для изучения механизмов регенерации сердца у позвоночных. Здесь мы приводим протокол для индукции инфаркта сердца у взрослых данио рерио использование cryoinjury. Этот метод приводит к массовой гибели клеток в пределах 20% от стенок левого желудочка, подобные наблюдаемым в млекопитающих инфарктов.
Млекопитающих, сердце не в состоянии значительного восстановления после острой травмы, такие как инфаркт миокарда 1. В отличие от хвостатых амфибий и костистых рыб сохраняют удивительную способность к регенерации сердца практически без рубцов в течение всей жизни 2,3. Не известно, почему только некоторые не-млекопитающих, позвоночных можно воссоздать полную орган из остатков ткани 4,5. Чтобы понять молекулярные и клеточные различия между восстановительной реакции в различных видов, мы должны использовать аналогичные подходы для стимулирования острой травмы.
У млекопитающих, наиболее часто используемые модели для изучения сердечных ремонта была острой ишемии после перевязки коронарной артерии или разрушение ткани после cryoinjury 6,7. Регенерации сердца у тритонов и рыбок данио были изучены преимущественно после частичной резекции верхушки желудочка 2,3. В последнее время несколько групп establбедных и обнищавших слоев cryoinjury техники у взрослых 8-10 рыбок данио. Этот метод имеет большой потенциал, поскольку она позволяет сравнительное обсуждение результатов, полученных от млекопитающих и не млекопитающих.
Здесь мы представляем метод вызывает воспроизводимую форму диска инфаркта данио желудочка cryoinjury. Эта травма модель основана на быстром замораживании-оттаивании тканей, что приводит к массовой гибели клеток около 20% кардиомиоцитов из стенок левого желудочка. Во-первых, небольшой разрез был сделан в грудь с иридэктомия ножницы, чтобы получить доступ к сердцу. Стенок левого желудочка непосредственно заморожены, применяя на 23-25 секунд из нержавеющей стали криозонда предварительном порядке охладить в жидком азоте. Чтобы остановить замораживание сердце, рыба при комнатной температуре была сброшена на кончике криозонда. Процедура хорошо переносится животными, с выживаемостью 95%.
Для характеристики процесса регенерации, сердца былисобрана и установлена на разные дни после cryoinjury. Затем образцы были внедрены для cryosectioning. Слайды с разделами были обработаны для гистологического анализа, гибридизация и иммунофлюоресценции. Это предприятие расширяет наши представления о факторах, которые необходимы для восстановительной пластики в данио рерио, а также обеспечить новому взглянуть на механизмы регенерации сердца. Концептуальные и молекулярной понимания сердца регенерации данио повлияет и биологии развития и регенеративной медицины.
Cryoinjury определяется как контролируемое повреждение ткани точное применение холода 14. Прямой тепловой удар разрушает клетки белком уничтожения и внутриклеточной жидкости, формирование кристаллов льда, который разрывает плазматической мембраны. Следовательно, поврежденные клетки погибают в процессе апоптоза и некроза 14. Оба эти механизма гибели клеток было показано, что способствует потере тканей после инфаркта миокарда 15. Таким образом, cryoinjury представляет собой подходящую модель вызывая инфаркт сердца. Ряд исследований об этом хорошо зарекомендовал метод в различных млекопитающих, включая мышей, крыс, кроликов и свиней 6,7. Адаптация cryoinjury протокол данио позволяет более сравнительного обсуждения инфаркт ответа между различными видами.
Две другие группы независимо друг от друга разработали cryoinjury процедуры для взрослого сердца данио. Основные различия заключаются в поверхностьГери методы, типа инструментов и прикладных время замораживания. В исследовании Гонсалес-Роза и соавт., Перикард открыл разрывая ткани вместо резки. Они использовали 0,3 мм медных нитей связан с трубкой полиамид предварительно охлажденный в жидком азоте, чтобы заморозить сердце на несколько секунд, пока оттаивания можно было наблюдать 10. В исследовании Шнабель и соавт., Конической части сухого льда длиной 20 мм с заостренным концом 2 мм в диаметре был использован, чтобы коснуться сердца в течение 10 секунд 8. Обе группы получили желудочка ущерб в результате смерти миокарда. Преимущество нашего метода является более воспроизводимой отложение коллагена богатых шрам, который лучше имитирует раннего инфаркта исцеления ответов наблюдается в млекопитающих.
Важный шаг в cryoinjury процедуру данио делает разрез через кожу и перикард без проколов основной сердце. Правильно performeг операция вызывает небольшое кровотечение. Обильное кровотечение указывает на непреднамеренный прокол левого желудочка с ножницами. В таких случаях животные должны быть втянута в эксперименте. Для того чтобы избежать проколов сердце, точки ножниц должна быть направлена под небольшим углом к коже.
Еще один важный аспект для создания воспроизводимых травмы точное позиционирование холодной криозонда на желудочка для оптимального точный срок. Слишком короткое время замораживания может привести к воспалению с небольшим гибели клеток. Длительные заморозки, с другой стороны, может привести к серьезным повреждениям сердца, что может привести к повышению смертности животных. Мы решили, что оптимальное время для проведения желудочка в замороженном состоянии диапазоне между 23-26 секунд на 2 см в длину взрослые данио рерио, и он может отличаться зависимо от размера животного.
Потому что наш протокол очень просто и быстро, нет никаких экспериментальных пределфлуктуации в подчинении достаточное количество животных для получения адекватной биологической репликации. Криохирургического лечения очень хорошо переносится животными. Коллекция сердца в различные моменты времени после cryoinjury позволяет подробную характеристику на последующих этапах в восстановительный процесс. Экспериментальный анализ cryoinjured сердца может включать: 1) Визуализация транскрипции генов путем гибридизации на месте, 2) определение белка распределения иммунофлуоресцентного окрашивания, 3) гистологические изображения различных структур. Понимание основных процессов заживления после инфаркта миокарда у данио повлияет области регенеративной биологии. Кроме того, он может быть полезным для разработки новых терапевтических подходов в регенеративной медицине.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим В. Циммермана за отличную техническую помощь и уход за рыбой. Эта работа выполнена при финансовой поддержке Швейцарского национального научного фонда, грант номер: 310000_120611.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc. | RS-5602 |
Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 |
Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 |
Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 |
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds – Truncated Molds T8 | Polyscience, Inc. | 18985 |