Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano
Summary
Descriviamo l'uso della tecnologia ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Che combina quantitative citometria di flusso con simultanea alta risoluzione digital imaging, per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie da ben definiti coorti di pazienti. I nostri studi forniscono un modello per le indagini traslazionali quantificare lignaggio risposte specifiche cellulari a piccoli campioni di coorti di soggetti.
Abstract
Variazioni individuali nel determinare le risposte stato immunitario alle infezioni e contribuire alla gravità della malattia e il risultato. L'invecchiamento è associato ad un aumento della suscettibilità alle infezioni virali e batteriche e diminuita capacità di risposta ai vaccini con un ben documentato calo umorale e cellulo-mediata 1,2 immune risposte. Abbiamo recentemente valutato gli effetti dell'invecchiamento sulla recettori Toll-like (TLR), componenti chiave del sistema immunitario innato che rilevano l'infezione microbica e di trigger antimicrobici risposte di difesa dell'ospite 3. In un'ampia coorte di donatori umani sani, abbiamo dimostrato che i monociti di sangue periferico di pazienti anziani hanno una ridotta espressione e la funzione di alcuni TLR 4 e simili livelli di TLR ridotti e le risposte di segnalazione nelle cellule dendritiche (DC), cellule presentanti l'antigene che sono fondamentale nella il collegamento tra immunità innata e adattativa 5. Abbiamo dimostrato di disregolazione TLR3 nei macrofagi unod minore produzione di IFN da parte di DCS donatori anziani in risposta ad infezione da West Nile virus 6,7.
Paramount alla nostra comprensione del immunosenescenza e di intervento terapeutico è una comprensione dettagliata di specifici tipi cellulari che rispondono e il meccanismo di (s) di trasduzione del segnale. Gli studi tradizionali di risposte immunitarie, attraverso l'imaging di cellule primarie e marcatori cellulari di rilevamento di FACS o immunoblot hanno avanzato la nostra comprensione significativo, tuttavia, questi studi sono generalmente limitati tecnicamente dal volume piccolo campione a disposizione di pazienti e l'incapacità di condurre complesse tecniche di laboratorio su più campioni umani. ImageStream combina citometria a flusso con quantitativa simultanea digitale ad alta risoluzione di immagini e quindi facilita indagine in popolazioni di cellule multiple contemporaneamente per una acquisizione efficace della sensibilità del paziente. Qui si dimostra l'uso di ImageStream nei PVS per valutare TLR7 / 8attivazione-mediate aumento nella fosforilazione e traslocazione nucleare di un fattore di trascrizione chiave, NF-KB, che inizia la trascrizione di numerosi geni che sono critici per le risposte immunitarie 8. Grazie a questa tecnologia, abbiamo anche recentemente dimostrato una alterazione precedentemente non TLR5 di segnalazione e il pathway NF-kB nei monociti da donatori anziani, che possono contribuire a una risposta immunitaria alterata nell'invecchiamento 9.
Protocol
Discussion
I passaggi critici in uso di ImageStream per gli studi traslazionali sono la selezione dei gruppi di confronto rilevanti e l'ottimizzazione e la convalida delle specificità anticorpale. Le differenze tra i gruppi di soggetti nel bersaglio marcato saranno subito evidenti attraverso istogrammi e le immagini di cellule. In combinazione con un'analisi approfondita dei cambiamenti nei recettori rilevanti e vie di segnalazione, questi dati forniranno informazioni preziose sui meccanismi che sono alla base disregolazi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato in parte dal NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089.992, e il NCRR / GCRC Programma M01-RR00125). Gli autori dichiarano di non conflitto di interessi finanziari e ringraziare il Dr. Mark Shlomchik, direttore del Fondo Anima a celle Yale Sorter.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Riferimenti
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
