Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed
Summary
We beschrijven het gebruik van ImageStream technologie (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Die een combinatie van kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking, te kwantificeren cellulaire mechanismen van primaire immuun cellen van goed gedefinieerde patiënten cohorten. Onze studies geven een blauwdruk voor translationeel onderzoek naar lineage specifieke cellulaire respons in kleine steekproeven kwantificeren van onder cohorten.
Abstract
Individuele variaties in het immuunsysteem van status te bepalen reacties op infectie en bij te dragen tot ernst van de ziekte en het resultaat. Veroudering gaat gepaard met een verhoogde gevoeligheid voor virale en bacteriële infecties en verminderde gevoeligheid voor vaccins met een goed gedocumenteerde daling van de humorale en cellulaire immuunrespons 1,2. We hebben onlangs onderzocht de effecten van de vergrijzing op de Toll-like receptoren (TLR), de belangrijkste componenten van het aangeboren immuunsysteem dat microbiële besmetting en trekker antimicrobiële afweer reacties 3 op te sporen. In een groot cohort van gezonde donoren, hebben we aangetoond dat perifere bloed monocyten van de ouderen hebben expressie en functie van bepaalde TLR 4 en soortgelijke verminderde TLR niveaus en signalering reacties in dendritische cellen (DC's) is gedaald, antigeen-presenterende cellen die cruciaal zijn in het verband tussen aangeboren en adaptieve immuniteit 5. We hebben aangetoond ontregeling van TLR3 in macrofagen eend een lagere productie van IFN door DCs van ouderen donoren in reactie op infectie met het West Nile virus 6,7.
Paramount aan ons begrip van immunosenescence en therapeutische interventie is een gedetailleerd inzicht in specifieke celtypes reageert en het mechanisme (s) van signaaltransductie. Traditionele studies van immuunresponsen door middel van beeldvorming van primaire cellen en landmeetkundige cel markers door FACS of immunoblot gevorderd ons begrip significant, echter, deze studies over het algemeen zijn technisch beperkt door de kleine steekproef beschikbare volume van patiënten en het onvermogen om complexe laboratorium technieken uit te voeren op meerdere menselijke monsters. ImageStream combineert kwantitatieve flowcytometrie met gelijktijdige hoge-resolutie digitale beeldbewerking en dus vergemakkelijkt onderzoek in meerdere celpopulaties gelijktijdig voor een efficiënte opname van de patiënt gevoeligheid. Hier laten we zien het gebruik van ImageStream in de ontwikkelingslanden te beoordelen TLR7 / 8activatie-gemedieerde toename van fosforylering en nucleaire translocatie van een belangrijke transcriptiefactor NF-kB, die de transcriptie van vele genen die essentieel zijn voor de immuunrespons 8 initieert. Met behulp van deze technologie, hebben we onlangs ook blijk gegeven van een eerder opgenomen wijziging van TLR5 signalering en de NF-kB route in monocyten van oudere donoren die kunnen bijdragen aan veranderde immuunrespons bij veroudering 9.
Protocol
Discussion
De kritische stappen in het gebruik van ImageStream voor translationeel onderzoek is de selectie van relevante vergelijking groepen en optimalisatie en validatie van antilichaamspecificiteit. Verschillen tussen subject groepen in het gemerkte doel zal snel duidelijk zijn via histogrammen en mobiele beelden. In combinatie met een grondige analyse van wijzigingen in relevante receptoren en signaalwegen, zullen deze gegevens een waardevol inzicht verschaffen in mechanismen die immuun ontregeling ten grondslag liggen in ges…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mede ondersteund door het NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, en de NCRR / GCRC Program M01-RR00125). De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen en dank dr. Mark Shlomchik, directeur van het Yale Cell Sorter Core Facility.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Riferimenti
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
- Shaw, A. C. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
- Medzhitov, R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).
- van Duin, D. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
- Panda, A. Age-associated decrease in TLR function in primary human dendritic cells predicts influenza vaccine response. J. Immunol. 184, 2518-2527 (2010).
- Kong, K. -. F. Dysregulation of TLR3 impairs the innate immune response to West Nile virus in the elderly. J. Virol. 82, 7613-7623 (2008).
- Qian, F. Impaired interferon signaling in dendritic cells from older donors infected in vitro with West Nile virus. J. Infect. Dis. 203, 1415-1424 (2011).
- Hayden, M. S., Ghosh, S. NF-kappaB in immunobiology. Cell research. 21, 223-244 (2011).
- Qian, F. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
- George, T. C. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological. 311, 117-129 (2006).
