Un lucido e rinforzato Assottigliato cranio-Window a lungo termine Imaging del cervello di topo

Summary

Presentiamo un metodo per formare una finestra di imaging nel cranio topo che si estende millimetri ed è stabile per mesi senza infiammazione cerebrale. Questo metodo è adatto per studi longitudinali di flusso sanguigno, dinamica cellulare, e cellule / struttura vascolare con microscopia a due fotoni.

Abstract

In vivo imaging della funzione corticale richiede l'accesso ottico al cervello senza interruzioni dell'ambiente intracranica. Vi presentiamo un metodo per formare un cranio lucido e rinforzato diluito (porte) finestra nel cranio del mouse che si estende su parecchi millimetri di diametro ed è stabile per mesi. Il cranio è diluito a 10 a 15 pm di spessore con una mano trapano per ottenere chiarezza ottica, e viene poi ricoperto con colla di cianoacrilato e un vetro di copertura a: 1) fornire rigidità, 2) inibiscono la ricrescita ossea e 3) ridurre la dispersione della luce da irregolarità sulla superficie dell'osso. Dal momento che il cranio non è violato, qualsiasi infiammazione che potrebbe influenzare il processo in fase di studio è notevolmente ridotto. Imaging profondità fino a 250 um sotto la superficie corticale può essere realizzato utilizzando due fotoni microscopia a scansione laser. Questa finestra è particolarmente adatta a studiare il flusso ematico cerebrale e la funzione cellulare in preparazioni sia anestetizzati e sveglio. Offre inoltre l'opportunità di manipolare l'attività delle cellule utilizzando optogenetics o per interrompere il flusso di sangue nei vasi destinatari irradiazione di circolazione fotosensibilizzanti.

Protocol

1. Preparazione per la chirurgia ⁱ

1. Pulire gli strumenti chirurgici dalla sonicazione in una miscela di latte Maxizyme e chirurgica in un pulitore ad ultrasuoni. Sterilizzare gli strumenti chirurgici prima di ogni esperimento.
2. Assicurarsi che tutti i reagenti necessari e monouso sono disponibili. Un elenco di reagenti e prodotti monouso è fornita in Tabella 2. Reagenti e monouso che vengono in contatto con il tessuto esposto deve essere sterile, quando possibile.
3. Indurre l'anestesia. Anestetici tipici adatti per studi di sopravvivenza sono descritti nella Tabella 1. Garantire piano di anestesia chirurgica controllando per mancanza di reflex punta pizzico. L'età ottimale del mouse è da 3 a 6 settimane di età. I crani di giovani topi sono più morbide e più difficili da sottili. Topi più anziani sono più spesse teschi che sanguinano di più durante la procedura di diradamento.
4. Fissare l'animale in un frame stereotassico ^1. Un elenco di apparecchi chirurgici è fornita in Tabella 2.
5. Mantenere la temperatura del corpotura a 37 ° C utilizzando una sonda rettale regolata feedback e cuscino termico.
6. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi per trattenere l'umidità.
7. Shave il cuoio capelluto con un rasoio elettrico piccolo.
8. Pulire il cuoio capelluto con Betadine, seguita da tampone al 70% (v / v) alcool isopropilico.
9. Se lo si desidera, controllare che la frequenza cardiaca e la respirazione sono all'interno di un range di normalità con un pulsossimetro. Per un mouse, questi numeri devono centro di circa 10 Hz e 2, rispettivamente.
10. Scaldare un'aliquota di filtrata sterile artificiale fluido spinale cerebrale (ACSF) a 37 ° C (125 mM NaCl, 10 mM di glucosio, 10 mM di HEPES, 3,1 mM CaCl _2, 1,3 mM MgCl _2, pH 7,4) (tutte le sostanze chimiche da Sigma) ^2.

2. Montaggio di un frame testa

1. Rimuovere il cuoio capelluto su tutta la superficie dorsale cranio con una coppia di pinze e forbici chirurgiche. Tagliare il pelle lateralmente ai bordi dei muscoli temporali su entrambi i lati del cranio e posterior ai muscoli del collo (Fig. 1A).
2. Utilizzare una lama di bisturi per rimuovere il periostio sottile dalla superficie del cranio.
3. Pulire il cranio con un applicatore con punta di cotone umido e asciugare la superficie del cranio con un flusso d'aria da una polvere può. Quindi applicare un sottile strato di colla di cianoacrilato l'intera superficie del cranio. Lasciare che la colla si asciughi completamente. Questo strato di colla è necessario per aderenza corretto del cemento dentale in fasi successive. La colla di cianoacrilato non deve essere sterilizzato.
4. Fissare un connettore metallico alla superficie del cranio, lontano dalla zona della finestra desiderata. Per i preparati anestetizzati, un dado piccolo può essere fissato al cranio con una piccola quantità di colla di cianoacrilato, che può essere successivamente avvitato nella configurazione di imaging mediante un bullone (Fig. 1B, 1L e 1N). Sigillare la parte posteriore del dado con nastro per garantire che la colla non inserire i fili durante l'attacco al cranio. Il dado e nastro devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'intervento.
5. Per i preparati di imaging svegli, collegare un connettore più rigido personalizzato con due punti di attacco (Fig. 1M e 1N). Praticare due fori nel cranio sopra l'emisfero controlaterale corticale con un ½ mm trapano bava, e poi introdurre due # 000 viti autofilettanti. Queste viti aiuterà ancorare montare la testa al cranio. Applicare solo un giro completo della vite, in modo da evitare di applicare pressione alla corteccia sottostante. Quindi, fissare il costume traversa di metallo con una goccia di colla cianoacrilato sul cervelletto. Lasciare che il collante cianoacrilato asciugare completamente. Questo connettore metallo riduce notevolmente i gradi di libertà e semplifica trasferimento del campo dell'imaging stesso in studi longitudinali. Una traversa gamma dà ampio spazio per il posizionamento degli elettrodi e la stimolazione di vibrisse. Piani dettagliati per la generazione del supporto personalizzato testa e dispositivo di fissaggio sono disponibili online (SICS / links.html "> http://physics.ucsd.edu/neurophysics/links.html). Le viti e la barra trasversale devono essere sterilizzati in autoclave prima dell'intervento.
6. Coprire l'intera superficie del cranio, escludendo la posizione della finestra, con uno strato di cemento dentale (Fig. 1C e 1D). Assicurarsi che tutti i bordi esposte della cute, sono coperti da cemento. I componenti del cemento dentale non devono essere sterilizzati.

3. La generazione di un lucido e rafforzato Assottigliato-cranio (porte) Window

1. Assicurarsi che bave trapano sono taglienti ed evitare di riutilizzarli. Utilizzando un basso numero di giri sul trapano dentistico, sottile di 2 mm per 2 mm rispetto alla regione di corteccia somatosensoriale con una bava ½ mm. Alternate tra bagnare il cranio con ACSF e poi asciugare la superficie del cranio con un leggero getto d'aria da un panno gas; umido per il raffreddamento, e secco per la diluizione. Ciò richiede assottigliamento attraverso lo strato spongioso del cranio, che possono sanguinare, ma può essere controlled sciacquando con ACSF (Fig. 1E). Il cranio inizia a flettersi sotto la leggera pressione del trapano quando è circa 50 um, ed i vasi piale deve essere visibile attraverso l'osso umido (Fig. 1F). A questo spessore, piccole macchie bianche all'interno dell'osso diventano visibili per alcuni secondi immediatamente dopo che la superficie del cranio asciutta viene umidificato.
2. A questo punto, il sottile osso ulteriormente. Utilizzare una velocità di punta più lento, vale a dire, 1000 rpm, che si rade la superficie del cranio con solo un leggero tocco. Con movimenti controllati mantenendo la punta di una penna e solo applicare una forza nella direzione laterale. L'osso deve essere ~~~V 10 a 15 um Nella spessore finale (Fig. 1G). Quando l'osso è sufficientemente sottile, le piccole macchie bianche nelle ossa non saranno più visibili quando la superficie del cranio secco inumidito.
3. Lucidare la regione della finestra con la polvere di ossido di stagno. Collegare un pre-made punta che è stato immerso in silicone sigillante acquario e condisegnato, lasciando una frusta rastremata (inserto, fig. 1H). La frusta silicone deve essere preparato almeno un giorno prima della chirurgia, e sterilizzata con 70% di isopropanolo prima dell'uso. Inserire una piccola presa di polvere sulla finestra con una goccia di ACSF (Fig. 1H). Agitare il slurry sulla finestra fino a dieci minuti sfiorando la punta della frusta mobile alla superficie del cranio. Lavare via la polvere di ossido di stagno accuratamente dalla finestra utilizzando ACSF e asciugare accuratamente l'osso con un leggero getto d'aria. Irregolarità della superficie e frammenti ossei aderenti hanno lasciato foratura nelle fasi precedenti devono essere rimossi dopo la lucidatura (Fig. 1H e 1I). La polvere di ossido di stagno non deve essere sterilizzato.
4. Tagliare pezzi quadrati di no. 0 vetro di copertura leggermente inferiore alla dimensione della finestra. Utilizzare uno scriba di segnare delicatamente separate le linee orizzontali e verticali in coprioggetto utilizzando un regolo. Quindi mettere il vetrino in una capsula di Petri e knock il piatto contro un bordo tabella per separare i pezzi di vetro. L'intera piastra di Petri possono essere sterilizzati in autoclave per garantire la sterilità.
5. Inserire un vetro di copertura di dimensioni adeguate nei pressi della finestra secca. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato sopra la finestra con la punta di un applicatore di legno rotta cotton-fioc, e rapidamente spingere il pezzo pretagliato di vetro di copertura sopra la colla. Evitare di creare bolle sotto il vetro di copertura. Spingere delicatamente il vetro di copertura contro la superficie del cranio, e tenere premuto per alcuni secondi (Fig. 1J e 1O). Lasciare che la colla si asciughi completamente nell'arco di 15 minuti. L'eccesso di colla di cianoacrilato può essere rimosso dalla superficie superiore del vetro di copertura con una lama di bisturi dopo che viene essiccato. Sigillare i bordi del vetro di copertura con cemento dentale e formano una leggermente sollevata e per contenere l'acqua per immersione della lente (Fig. 1K e 1O).

4. Recupero

1. Mettete l'animale in un intervento chirurgico temperatura in gabbia. Monitorare ilanimale periodicamente fino al completo recupero dall'anestesia.
2. Se il preparato è destinato a sopravvivere per più di un giorno, fornire buprenorfina (0,03 pg per roditori g) per analgesia. Abbiamo tipicamente immagine dell'animale almeno un giorno dopo l'impianto iniziale.

5. Imaging Preparazione

1. Stabilizzare l'animale su una basetta per l'imaging ottico, utilizzando la cornice come supporto per la testa (Fig. 1L e 1M). Un dispositivo di ritenuta può essere costituito da componenti optomechanical commercialmente disponibile da Qioptiq o Thorlabs. Il nostro piatto a parte può essere trasportato tra le suite di imaging chirurgici e due fotoni con l'animale e tutti i dispositivi di monitoraggio fisiologico assemblati come una sola unità ^3.
2. Se il flusso sanguigno immagini si desidera, iniettare 0,05 mL del 5% (w / v) fluorescente-destrano colorante disciolto in soluzione fisiologica sterile attraverso la vena della coda o vena infraorbitale per etichettare il siero del sangue (Fig. 2A e 2C a 2H 4-7. Questo deve essere fatto in anestesia generale. Amministrazione vena infraorbitale può essere più facile per i principianti, come soluzioni di destrano sono più viscoso. La vena della coda può essere difficile individuare in topi di colore scuro, e la vena tende a collassare dopo una iniezione fallito. Per l'imaging vascolare con il verde delle emissioni, usare un isotiocianato di fluorescina destrano. Per emissione rossa, utilizzare un Texas Red destrano. Con alto peso molecolare destrani, il colorante rimane in circolazione per diverse ore. In alternativa, gli animali con endogeni etichette fluorescenti possono essere esposte direttamente al momento opportuno a due fotoni di lunghezza d'onda di eccitazione. La soluzione destrano può essere congelato in aliquote per uso futuro.
3. Pulire delicatamente la superficie della finestra con un applicatore con punta di cotone umido.
4. Per l'imaging prolungata delle preparazioni anestetizzati, iniettare per via intraperitoneale soluzione sterile di Ringer lattato presso un volume di 3 pl per grammo ogni 2 ore per mantenere i fluidi corporei ei requisiti energetici. </ Li>
5. Quando gli animali di imaging in stato di veglia, limitare poggiatesta per poche ore alla volta per ridurre i livelli di stress. Rispedire l'animale verso la gabbia a casa tra le sessioni di imaging per il cibo e l'acqua.

6. Risultati rappresentativi

Una finestra corretta vi permetterà di imaging profondità fino a 250 micron sotto la superficie piale per diversi mesi. Questo metodo è stato utilizzato per studiare in vivo flusso sanguigno capillare ^{4, 8,} attivazione della microglia ^{8, 9,} e all'interno della struttura dendritica corticale parenchima ^8. In un esempio, si usa due fotoni imaging per mostrare la vascolatura corticale di una anestetizzato Thy1-giallo proteina fluorescente (YFP) topo, dopo il siero del sangue è etichettato mediante iniezione endovenosa di Texas Red destrano (Fig. 2A). Vasi durali sono spesso visibili leggermente al di sopra della superficie corticale della dura madre (Fig. 2C, freccia). Grandi piale arteriole e venule lie sulla superficie corticale (Fig. 2D). Penetrante ramo navi da questa rete di superficie e immergersi nella corteccia dove si ramificano in un letto denso capillare che alimenta il tessuto corticale (Fig. 2E a 2H). Pergole dendritiche di YFP profonda esprimere i neuroni corticali, una endogena di segnale a questa linea di topi, possono essere esposte contemporaneamente in un secondo canale ¹⁰ (Fig. 2B a 2H). Il segnale di seconda armonica della osso è stato raccolto in un terzo canale, e può essere utilizzato per misurare lo spessore del cranio assottigliata dopo il prelievo di pile di immagine (Fig. 2A a 2C).

Corticali dinamiche vascolari sono profondamente colpiti da anestetici ^11. In un secondo esempio, mostriamo un video di vasoactivity spontanei raccolti da microscopia a due fotoni da un topo abituata sveglio. Oscillazioni vasomotorie rilievo del diametro del lume sono visti con una arteriola piale, ma non con un venule vicina. Questogamma basale di vasoactivity è diminuita con ⁴ uretano anestesia. Per quantificare i cambiamenti spontanea ed evocata nel flusso sanguigno, usiamo tecniche adeguate linee di scansione per catturare sia il diametro vascolare e la velocità dei globuli rossi dei singoli pescherecci. Informazioni più dettagliate sulle immagini quantitativa del flusso sanguigno tramite microscopia a due fotoni sono disponibili ^{3, 12.}

Figura 1. Procedura per una finestra Porte. (Dalla A alla K) Immagini di passi sequenziali nella procedura per la generazione di una finestra porte. Vedere il testo per le istruzioni dettagliate. β = bregma e λ = lambda. (L) del sistema di dadi e bulloni per il fissaggio della testa durante l'imaging di preparati anestetizzati. (M) Custom lavorati croce mount testa bar per la preparazione svegli. In questo esempio, un connettore stato impiantato anche per registrazioni electrocorticogram ripetuti. (N)Diagramma schematico che mostra vista dorsale del supporto testa e la posizione dei vari componenti. Il dado utilizzato in L pannello è inteso come alternativa alla traversa con pannello in M. Two # 000 viti autofilettanti sono aggiunti con la traversa di montaggio per una maggiore stabilità con preparazioni di imaging svegli. (O) Schema che illustra la sezione trasversale di una finestra Porte.

Figura 2. Imaging a due fotoni della struttura vascolare e neuronale nel topo corteccia. Tutte le immagini sono state raccolte attraverso una finestra porte in un Thy1-YFP del mouse a 2 giorni dopo l'impianto finestra ^10. Sporgenza massima oltre 150 micron di tessuto nell'orientamento coronale mostra il cranio diluito in relazione al sistema vascolare (A) e dendriti (B). L'osso (blu) è stato rilevato raccogliendo la seconda armonica fluorescenza a 450 nm di emissione di 900 nm di eccitazione 6. I campi dendritiche dei neuroni (verde) sono endogeni al Thy1-YFP linea di topi transgenici. (CH) proiezioni massime oltre 50 micron di tessuto in orientamento orizzontale a diverse profondità al di sotto della pia. I dati sono dalla pila stessa immagine mostrata in pannelli A e B. navi Dural può essere visibile appena sopra la superficie corticale (freccia in C).

Abbreviazioni

ACSF = artificiale liquido cerebrospinale
PORTI = finestra lucidato e rinforzato cranio diluito
YFP = proteina fluorescente gialla

^{mi assicuro} che le procedure descritte sono approvati cura del Suo locale Animal istituzionale e Usa comitato.

Discussion

Two-photon immagini attraverso una finestra Porte richiede la trasmissione attraverso l'osso assottigliata e la dura madre, che attenua la luce laser e aggiunge aberrazioni ottiche a maggiori profondità ^8. Tuttavia, nonostante questo inconveniente, profondità di imaging fino a 250 um sotto la superficie piale può essere ottenuto con eccitazione 900 nm. Profondità maggiori di imaging possono in linea di principio essere possibile con lunghezze d'onda di eccitazione più ^13. Un importante vantaggio di questo metodo è l'assenza di infiammazione corticale che potrebbero esistere transitoriamente in metodi che comportano piena craniotomia ^{14, 15.} Una finestra ben preparato porti dovrebbero non mostrano evidenti segni di infiammazione e angiogenesi dopo l'impianto ^8. Questa può essere valutata in vivo nel corso dell'esperimento da struttura di imaging vasi, o rilevando variazioni morfologiche della microglia nel CX (3) CR1-GFP topo linea ^{8, 16, 17.} Inoltre, post hoc immunoistologia dovrebbe essere performata per confermare l'assenza di astrogliosis nella corteccia superficiale, per esempio, utilizzando un anticorpo per la proteina gliale fibrillare acida ^8.

Il passo più esigente nella generazione di una finestra Porte si assottiglia l'osso a 10 a 15 pm di spessore. Esame periodica della finestra con un ampio campo microscopio a fluorescenza dissezione è anche utile per misurare lo spessore cranio durante la procedura di assottigliamento. Le etichette fluorescenti vicino alla superficie corticale, devono essere chiaramente visibile attraverso il cranio bagnato. Per una misura più accurata di spessore cranio, il segnale di seconda armonica dall'osso può essere misurata in una pila tridimensionale in microscopia a due fotoni (Fig. 2A a 2C). Se questo è fatto prima dell'applicazione della colla e vetro di copertura, l'osso e può essere ulteriormente assottigliato, se necessario. Insufficiente diradamento risultati in profondità di imaging poveri. Lucidatura continuerà ad assottigliare il cranio quando la perforazione non è più possibile, e vi aiuteràridurre le irregolarità superficiali e frammenti ossei aderenti. In studi preliminari, abbiamo trovato che la lucidatura migliora la profondità di imaging settimane dopo l'impianto iniziale. Tuttavia, un'analisi rigorosa il beneficio di lucidatura non è stata eseguita.

L'applicazione di colla di cianoacrilato e vetro coperchio cima l'osso è un punto critico per ridurre la dispersione della luce e consentire più immagini. Grazie al processo di perforazione, la superficie dell'osso sarà irregolare, anche dopo lucidatura, e quindi scattering della luce. L'applicazione di colla di cianoacrilato riempie in queste irregolarità e il vetro di copertura sovrastante lascia un non-scattering superficie liscia. È importante, gli indici di rifrazione per la colla e vetro di copertura, che sono 1,45 e 1,52 secondo le specifiche del costruttore, sono strettamente indicizzati abbinati a quella dell'osso a 1,55 ^18. Questo è un miglioramento rispetto avente aria o acqua al di sopra del cranio assottigliata, che hanno indici di rifrazione di 1,00 unod 1,33. Criticamente, il collante cianoacrilato contribuisce ulteriormente a impedire la ricrescita ossea. Questo permette l'imaging longitudinale fino a tre mesi, senza la necessità di manutenzione aggiuntivo dopo l'intervento iniziale.

Una seconda causa della profondità di imaging poveri è piale danni ai vasi che portano a emorragie o edema. Le vibrazioni del trapano dovrebbe essere minimizzato. In una piccola percentuale di casi, sanguinamento all'interno della dura sarà inevitabile. Questo perché la vascolarizzazione della dura madre è continua con il plesso vascolare del cranio, che viene disturbato durante la procedura di assottigliamento. Preparati con qualsiasi segno di emorragia sub-durale deve essere scartato l'ispessimento durale e l'angiogenesi ne deriverà. Il tasso di successo della finestra porte possono raggiungere il 80% con la pratica.

Per alcuni esperimenti, può essere necessario iniettare coloranti / virus o inserire elettrodi nel tessuto sotto la finestra Porte. È possibile generare un piccoloforo adiacente alla finestra, attraverso cui pipette o elettrodi può essere introdotto utilizzando un braccio stereotassico o Sutter manipolatore ^19. Questo foro può essere richiusa con cera ossa se l'animale debba essere ripreso ancora una volta nelle sessioni future. Tuttavia, l'introduzione di elettrodi può naturalmente piombo all'infiammazione nella patologia corteccia e acute come diffusione depressione.

La finestra I porti dovrebbero essere adatto per qualsiasi modalità di imaging che richiedono accesso ottico al cervello. Ciò comprende le tecniche di imaging quali la superficie intrinseca imaging ottico e laser speckle ²⁰ immagini ^21, ottici o tecniche di sezionamento, come ²² o confocale a due fotoni microscopia ^23. Inoltre, una preparazione porti dovrebbero migliorare la risoluzione in ampi campi transcraniali tecniche di imaging quali la tomografia a coerenza ottica e la microscopia fotoacustica ^{24 25.}

Infine, la finestra Ports èadatto per l'imaging di animali sveglio come il vetro di copertura aggiunge rigidità alla finestra ^4. Il supporto testa è ulteriormente stabilizzata mediante l'introduzione di due autofilettanti # 000 viti alla emisfero controlaterale prima applicazione del cemento dentale (Fig. 1L). Abitudine alla testa di fissazione è importante per il movimento degli animali ridotto durante imaging. Un nuovo animale può essere gradualmente abituati a appoggiatesta per un periodo di 3 a 7 giorni prima di imaging, partendo con 15 min e sessioni di lavoro fino a diverse ore.