Summary
Neste estudo, nós descrevemos um protocolo melhorado para um microarray anticorpo multiplexado de alto rendimento com o método de detecção de lectina que pode ser usado em perfil de glicosilação de proteínas específicas. Este protocolo apresenta novos reagentes fiáveis e reduz significativamente o tempo, custo e requisitos de equipamento de laboratório, em comparação com o procedimento anterior.
Protocol
1. Imprimir um microarray de anticorpos para o Ensaio
- Diluir todos os anticorpos para 0,5 mg / ml em solução salina de tampão fosfato, pH 7,2 (PBS).
- Alíquota 40 uL de cada anticorpo na placa de fonte 384 poços.
- Coloque a placa de fonte de 384-bem para o microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
- Carregar 20 lâminas de microarray PATH para o microarrayer como alvo.
- Defina o microarrayer para imprimir 48 subarrays idênticas, em que 27 anticorpos e proteínas de controle são vistos em triplicado em um padrão 9x9 (Figura 1E, 1F).
- Inicie o microarrayer para imprimir os slides microarray de anticorpos.
- Colete as lâminas de microarray de anticorpos, e armazená-los em lâminas cassete com dessecante. Aspire selar a cassete em um saco plástico usando vácuo sealer (FoodSaver).
- Armazenar as lâminas microarray seladas a 4 ° C no frigorífico.
2. Quimicamente Bloquear o microarray de anticorpos para Prevenir GBPLigação aos anticorpos de captura
O ensaio é iniciado microarray uma vez que as lâminas microarray são quimicamente bloqueado e dura cerca de 8 horas. Uma vez iniciado o ensaio de microarray tem de ser concluída (Passos 2 a 8).
- Leve o microarray desliza para fora da geladeira, e equilibrar-los à temperatura ambiente por 30 minutos.
- Remover a corrediça a partir da caixa de armazenamento e brevemente enxagúe em tampão fosfato pH 7,2 salina com 0,1% de Tween 20 (PBST0.1) uma vez em uma lâmina de lavagem bacia e, em seguida, em 15 mM de tampão acetato de sódio pH 5,0 com 0,1% de Tween (CBT0 .1) de uma forma sequencial. Incubar as lâminas em CBT0.1 durante 10 minutos em bacia lâmina de lavagem.
- Prepare 150 mM fresco NaIO 4 em 15 mM tampão acetato de sódio pH 5,0 (CB), e mantê-lo em em um slide lavatório em um refrigerador, evitando a luz antes do uso.
- Remova a lâmina do CB, e colocá-lo na bacia contendo NaIO fresco 4 com o lado de anticorposvoltada para cima. Cobrir a bacia com folha de alumínio para evitar a luz, e incubar a bacia corrediça durante 2 horas com agitação suave a 4 ° C num frigorífico.
- Preparar 300 mL de 10 mM de ácido glutâmico hidrazida (o bloqueador) em CB.
- Remover o slide da bacia, e lave-o brevemente no CB 3 vezes durante 5 minutos de cada vez na bacia de slides de lavar roupa.
- Incubar as lâminas no bloqueador numa bacia de lavagem durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave.
- Retire as lâminas da bacia, e lavá-los com PBST0.1 por 3 minutos.
3. Bloquear ligações não específicas para o Microarray com albumina de soro bovino (BSA)
- Preparar 300 ml de BSA a 1% em tampão fosfato pH 7,2 com Tween salina a 0,5% (PBST0.5) numa bacia lâmina de lavagem, e incubar a corrediça microarray na bacia durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave.
- Lavam-se as lâminas em PBST0.1 três vezes durante 3 minutos de cada vez.
- Coloque o slideem um porta-lâminas, e centrifugação a 1.200 xg em uma centrifugação durante 2 minutos para secar a corrediça microarray.
4. Imprint Grade cera para o slide Microarray para separar cada subarray
- Pré-aquecimento do impressor de cera, a 70 ° C durante 5 minutos.
- Carregue a lâmina de microarray bloqueado no imprinter cera com anticorpo lado virado para a cera. Puxe delicadamente a alça de cera marca na lâmina uniformemente.
5. Aplicar amostras de soro para o slide Microarray
- Durante o Passo 2.4, preparar amostras de soro para qualquer ensaio de perfil glico em uma amostra (5.1.1), ou único glico medição epiptope entre várias amostras (5.1.2).
- Em uma experiência para os profilings glicano de múltiplas glicoproteínas em uma amostra de soro usando GBPs múltipla (ver exemplo de experimento 1), uma amostras de soro irá ser aplicado sobre todos os subarrays. Neste caso, 40 uL ampla soro é diluído em 360 ul de PBS contendo 0,1%Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / mL de IgG de rato, 100 ug / mL de rato IgG, 100 ug / mL de IgG de coelho, 100 ug / mL de IgG de cabra e 100 ug / ml de burro IgG. Este volume é suficiente para a aplicação de 6 uL de solução de soro diluído em cada subarray.
- Em uma experiência para a medição de glicano um em várias proteínas séricas entre múltiplas amostras de soro utilizando um detecções GBP (ver experiência amostra 2). Neste caso, 1 ul ampla soro é diluído em 9 ul de PBS contendo 0,1% de Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / mL de IgG de rato, 100 ug / mL de rato IgG, 100 ug / mL de IgG de coelho , 100 ug / mL de IgG de cabra e 100 ug / mL de burro IgG. Este volume é suficiente para a aplicação de 6 uL de solução de soro diluído em cada subarray.
- Após impressão de cera no Passo 4, cuidadosamente aplicar 6 uL das amostras diluídas ou amostras de controlo (PBST0.1) para cada subarray da lâmina. Incubar a lâmina em um cassete umidificado com toalhas de papel molhadas em temperatura ambientedurante 1 hora.
- Lavar a lâmina com PBST0.1 três vezes para 3 minutos de cada vez.
- Secar a lâmina girando-o em 1200 xg por 2 minutos.
6. Aplicar GBP biotinilado (anticorpo ou Lectina Anti-glicano) para o slide
- Durante o Passo 2.4, preparar 10μg/ml de lectinas biotiniladas / Gbps em PBST0.1.
- Em glicano experimento perfil que sonda uma amostra com lectinas múltiplos (exemplo de experimento 1), preparar 350 uL de lectina biotinilada que é suficiente para todos os subarrays.
- Em único epítopo de triagem / biomarcador glicano em amostras múltiplas usando lectinas múltiplas, preparar 10 uL de cada lectina biotinilado que é suficiente para uma subarray.
- Aplicar 6 uL da lectina diluída biotinilado (s) para cada subarray da lâmina, e incubar na caixa corrediça humidificada com toalhas de papel molhado à temperatura ambiente durante 1 hora.
- Lavar as lâminas com PBST0.1 três vezes por 3 minutos cada time.
- Secar a lâmina girando-o em 1200 xg em centrífuga de 2 minutos.
7. Aplicar NeutrAvidin Identificada Dye para detecção da fluorescência
- Prepare-se 350 uL de Dylight NeutrAvidin 549 rotulado que é suficiente para todos os subarrays.
- Aplicar 6 uL de Dylight NeutrAvidin 549 rotulados para cada subarray, e incubar a lâmina na cassete de corrediça humidificada à temperatura ambiente durante 1 hora.
- Lavar a lâmina com PBST0.1 três vezes para 3 minutos de cada vez.
- Secar a lâmina girando a ele em 1200 xg em centrífuga de 2 minutos.
8. Obter Microarray de corrediça da imagem por varredura do Slide
- Digitalização do slide usando um scanner de microarray de fluorescência em resolução de 10 mM. Os parâmetros utilizados e PMT deve ser o mais forte possível, mas nenhum ponto de saturação é observado.
9. Extração de dados e análise
- Abra a imagem no ArrayPro 3.2. Configure o modelo de matriz de acordo com o mapa matriz que mostra os pontos dos locais de anticorpos. Cuidadosamente alinhar cada círculo do molde para o ponto correspondente na imagem.
- Extrai-se a intensidade de cada mancha em um arquivo Excel para análise posterior.
10. Os resultados representativos
Experimento Amostra 1
Perfil de glicosilação de múltiplas glicoproteínas em hepatocelular amostra do paciente carcinoma soro usando microarray anticorpo quimicamente bloqueada com detecção lectinas múltipla.
O objetivo deste experimento é explorar o perfil de glicosilação indivíduo de 20 glicoproteínas no carcinoma hepatocelular (HCC) amostra de soro do doente através de microarray de anticorpos quimicamente bloqueada com detecção de lectina. Um microarray anticorpo, que contém 48 subarrays idênticos que incluem anticorpos e 26 biotina-BSA, foi concebido e produzido como descrito em Step 1. Estes anticorpos foram 26 contra 20 glicoproteínas que identificados como promissores valor diagnóstico precoce para pacientes com carcinoma hepatocelular usando imunoprecipitação baseado lectina combinada com a identificação da proteína de massa por espectrometria de 12, 32 como mostrado na Tabela 1. O padrão e disposição dos pontos de anticorpos impressas em triplicado em um subarray representativo são apresentados na Figura 1E e 1F, respectivamente. Duas lâminas microarray idênticos, não era um quimicamente bloqueado (Figura 1A), enquanto o outro foi (Figura 1B), foram utilizados para realizar a experiência de perfis mesmo glicosilação, a fim de demonstrar a importância do procedimento quimicamente de bloqueio para a análise. Para a corrediça quimicamente bloqueado (Figura 1B), a experiência começou no Passo 2; para a nenhum corrediça quimicamente bloqueado (Figura 1A), o experimento iniciado a partir do Passo 3. O experimento foi conduzido por following todos os passos descritos no protocolo exceto para a etapa 5.1.2 e 6.1.2. No Passo 5,2, uma amostra de controlo PBST0.1 foi aplicada sobre subarrays na coluna 1 e 3, e um pool HCC amostra de soro foi aplicado sobre subarrays na coluna 2 e 4, respectivamente (como mostrado na Figura 1G). Esta comparação é o de mostrar a eficácia, a eficiência do processo, bem como a afinidade de ligação ao antigénio dos anticorpos após quimicamente bloqueio. 22 lectinas biotinilado (como mostrado na Tabela 1) que específico para glicanos diferentes 18, 20 foram aplicadas em cada subarray como mostrado na Figura 1G para perfilação de glicosilação. Imagens das quimicamente bloqueados (Figura 1B) e não-bloqueado quimicamente (Figura 1A) microarrays após o ensaio de perfil de glicosilação, seguindo o protocolo. Como mostrado nas subarrays na coluna 1 e 3 em não-quimicamente microarrays bloqueados (Figura 1A e Figura 1C), sobre as quaisapenas PBST0.1 foi aplicada, a maioria das lectinas ligado para capturar os anticorpos, e mostrou fundo muito elevada que comparável aos subarrays na coluna 2 e 4, em que a amostra de soro foi aplicado. É impossível obter informações de perfil de glicano este slide microarray. Pelo contrário, quando a mesma experiência foi realizada sobre uma lâmina quimicamente bloqueada anticorpo microarray, os subarrays na coluna 1 e 3, sobre os quais é apenas PBST0.1 foi aplicada, a maioria das lectinas mostrou ligações nenhum ou muito baixo para capturar os anticorpos, enquanto que o antigénio de alto ligações foram ainda observados em subarrays na coluna 2 e 4, em que foi aplicada amostra de soro (Figura 1B e 1D). Estes resultados mostraram o procedimento quimicamente bloqueio foi um passo crítico tona a medição de glicanos de anticorpo capturado glicoproteínas. Seguindo o protocolo, os perfis de glicosilação de 22 glicoproteínas em CHC soro pode ser obtida.
Experimento 2
Tela para fucos alteradosylation em glicoproteínas específicas como biomarcadores para cirrose hepática discriminadas e pacientes com carcinoma hepatocelular.
O objetivo deste experimento é a tela para fucosilação alteradas em glicoproteínas específicas como biomarcadores que discriminam cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (HCC) pacientes. Diferente da Experiência 1, em que apenas uma amostra de soro foi aplicado sobre a cada subarrays e sondadas com lectinas vários, neste ensaio, o total de 40 diferentes amostras de soro de HCC e cirrose pacientes foram aplicadas em cada subarray, e sondado com um lectina (AAL ). A análise estatística, tais como teste T, receiver operating-curva característica (ROC), foi feito para avaliar a distribuição ou a realização de diagnóstico da epiptope glicano / biomarcador em cada proteína individual em todas as amostras de soro. Utilizou-se o mesmo anticorpo microarray fabricado na Experiência 1, com excepção para o anti-CA19-9 e anticorpos anti-Lewis X neste estudo. O experiment foi realizado de 02 de setembro para o Passo 9, exceto para o Passo 5.1.1 e 6.1.1. Total de 40 amostras de soro de 20 cirrose e 20 pacientes com carcinoma hepatocelular foram aplicados em subarray aleatória dos 48 subarrays, juntamente com as amostras de controlo de PBS como controlo negativo. Fucosilação de cada proteínas dos capturados foi então detectada usando lectina-fucose específico biotinilado. A imagem microarray mostrado na Figura 1 demonstram a AAL lectina apenas ligada a proteínas séricas capturadas no microarray (Figura 2D) em vez de anticorpos capturados (Figura 2E). As intensidades AAL de ligação de todas as manchas foram então extraídos e analisados usando teste T e as curvas de ROC para avaliar o desempenho do fucosilação (intensidade de ligação AAL) de cada proteína de soro sobre a discriminação entre os grupos e HCC cirrose. Os resultados mostraram que a proteína GP73 de fucosilação deu a melhor discriminação entre os dois grupos com p = 0,03 e área sob acurva da curva de ROC igual a 0,72. Esta experiência demonstrou este procedimento é um método rápido e eficiente para o rastreio de glicano epítopo / biomarcador em amostras múltiplas dentro múltiplas proteínas.
ID | Nome do reagente | Abreviatura | Companhia | Catalogo |
L1 | Concanavalina A biotinilado | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L2 | Biotinilado Sambucus Nigra Lectina | SNA | Vector Laboratories | B-1305 |
L3 | Biotinilado Lens culinaris aglutinina | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L4 | Biotinilado Ricinus communis aglutinina eu | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L5 | Biotinilado Aleuria Lectina Aurantia | AAL | Vector Laboratories | B-1395 |
L6 | Biotinilado Erythrina Lectina Cristagalli | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L7 | Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Lectina Simplicifolia II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
L8 | Biotinilado Gérmen de Trigo aglutinina | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L9 | Erythroagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
L10 | Leucoagglutinin vulgaris biotinilado Phaseolus | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
L11 | Bioaglutinina de amendoim tinylated | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L12 | Biotinilado Pisum sativum aglutinina | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L13 | Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L14 | Lectina Stramonium biotinilado Datura | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L15 | Aglutinina Sophora Japonica biotinilado | SJA | Vector Laboratories | BK-2000 |
L16 | Aglutinina de soja biotinilado | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
L17 | Biotinilado Solanum tuberosum (Batata) Lectina | STL | Vector Laboratories | BK-3000 </ Td> |
L18 | Biotinilado griffonia simplicifolia Lectina (Bandeiraea) I | Eu GSL | Vector Laboratories | BK-2000 |
L19 | Biotinilado Vicia Lectina Villosa | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
L20 | Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) Lectina | LEL | Vector Laboratories | BK-3000 |
L21 | Ulex biotinilado Europaeus aglutinina eu | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
L22 | Jacalina biotinilado | Jacalina | Vector Laboratories | BK-3000 |
A1 | F cabra (ab ') 2 Fragmento IgM anti-humana, o anticorpo Fc5μ | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
A2 | Burro F (ab ') 2Frag IgG anti-humano de anticorpo (H + L) | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
A3 | De ratinho anti-IgG humana F (ab ') 2 de anticorpo monoclonal | AB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
A4 | Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticorpo policlonal | A2M | GeneTex | GTX62924 |
A5 | De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
A6 | De ratinho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina monoclonal | A1AT | Sigma Aldrich | SAB4200198 |
A7 | De coelho anti-anticorpo humano alfa-1-antitripsina policlonal | ACT | Neomarkers | RB-367-A1 |
A8 | De coelho anti-humano de alfa-1-antichymotrypsin anticorpo policlonal | ACT | Fisher Scientific | RB9213R7 |
A9 | Rato anti-humana de anticorpo monoclonal de transferrina | Transferrina | GeneTex | GTX101035 |
A10 | De coelho anti-anticorpo humano policlonal de transferrina | Transferrina | GeneTex | GTX77130 |
A11 | Cabra anti-humano apolipoproteína anticorpo policlonal J | ApoJ | Abcam | ab7610 |
A12 | Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
A13 | Rato anti-humana de GP73 anticorpo monoclonal | GP73 | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-101.275 |
A14 | De coelho anti-anticorpo humano de alfa-1 fetoproteína policlonal | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
A15 | De ratinho anti-anticorpo humano de alfa-1 fetoproteína monoclonal | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
A16 | Rato anti-humana de anticorpo monoclonal hemopexina | Hemopexina | Assaypro | 60190-05011 |
A17 | Rato anti-humano glypican-3 (1G12) anticorpo monoclonal | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65.443 |
A18 | Rato anti-humano Cininogênio anticorpo (LMW) monoclonal | Cininogênio | Assaypro | 20333-05011 |
A19 | De coelho anti-anticorpo humano MMP-21 monoclonal | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
A20 | Rato anti-humano CEACAM-1 anticorpo monoclonal | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
A21 | Rat anti-humano DPPIV/CD26 anticorpo monoclonal | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
A22 | Rato anti-humano PIVKA anticorpo monoclonal II | PIVICA | Cristal chem | 8040 |
A23 | Antigénio de ratinho anti-carcinoembriónico | CEA | EUA biológica | C1300 |
A24 | Antigen de ratinho anti-CA125 Câncer | CA125 | EUA biológica | C0050-01D |
A25 | Antigénio de ratinho anti-CA19-9 Câncer | CA19-9 | EUA biológica | C0075-18 |
A26 | De ratinho anti-Lewis anticorpo monoclonal x | Lewis X | Calbiochem | 434631 |
bio | Biotinilado BSA (controle positivo) | Bio | Home-made | N / A |
Lista Tabela 1. De lectinas e anticorpos utilizados neste protocolo.
Nome do reagente s / equipamentos | Companhia | Número de catálogo |
Microarrayer sem contato | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
384 microplacas | Pescador | 14-230-243 |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
Nitrocelulose Ultrathin Coate microarray desliza | Gentel | PATH |
Deslize Imprinter (opcional) | A Companhia Gel | WSP60-1 |
Sacudidor | Pescador | 15-453-211 |
Centrifugar | Eppendorf | 5804 000.013 |
Deslize lavatório / Slide Coloração Dish wiª removível rack | Pescador | 08-812 |
Deslize incubação caixa de lâminas câmara / microscópio | Pescador | 03-448-5 |
Brij 35, 30% de solução w / v em água | Acros Organics | AC32958-0025 |
Tween-20 | Pescador | P337-100 |
Periodato de sódio (NaIO4) | Sigma | 311448 |
Ácido L-glutâmico γ-hidrazida | Sigma | G-7257 |
De acetato de sódio anidro (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
Albumina de soro bovino (BSA) | Lampire Biológica Labs | 7500804 |
Tampão fosfato salino (PBS) (10X) | Denville Científico | CP4390-48 |
Dylight NeutrAvidin 549 conjugado | Thermo | 22837 |
Protease Comprimidos Coquetel Inibidor | Roche | 4693159001 |
ChromPure IgG humana, fragmento Fc | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
ChromPure IgG humana, molécula inteira | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
ChromPure IgG de rato, molécula inteira | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
ChromPure IgG de rato, fragmento Fe | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
ChromPure IgG de coelho, molécula inteira | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
ChromPure Donkey IgG, molécula inteira | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
Microarray Scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tabela 2. Listade equipamentos e reagentes utilizados neste protocolo.
Esquema 1 Um esquema que mostra a microarray anticorpo lectina baseado glicano processo descoberta de biomarcadores 1 (Passo 2 a 4): Bloquear o microarray anticorpo com o bloqueador (Glu-hidrazida) e BSA; 2 (Passo 5):.. Aplicar amostras de soro e capturar glicoproteínas específicas com anticorpos específicos; 3 (Passo 6): aplicam lectina biotinilada (s), 4 (Passo 7): Sonda o AAL biotinilado com Dylight NeutrAvidin 549 rotulado para microarray de imagem.
Figura 1. Imagens Microarray da Amostra perfil de glicosilação Experimento 1 de múltiplas glicoproteínas em HCC amostra de soro do doente usando chemicaliado bloqueado microarray de anticorpos com a detecção de lectina múltipla. Duas lâminas microarray idênticos, (a) nenhum quimicamente bloqueada, ou (B) quimicamente bloqueado, tal como descrito no Passo 2, ambos passou por todas as etapas de 2 a 9 para o perfil de glicosilação, bem como para fins de comparação. (A) e (B) são as imagens microarray digitalizada no Passo 8, em uma resolução de 10 micron. (C) o zoom na imagem das duas primeiras linhas da nenhum quimicamente bloqueada microarray corrediça (A), (D) o zoom na imagem das duas primeiras linhas da lâmina não microarray quimicamente bloqueado (B)); (E) o diagrama da disposição anticorpo dentro de cada subarray; (F) mapas de matriz: a localização de cada anticorpo dentro do subarray, cada nome de anticorpo representa 3 manchas; (G) da amostra de soro e localização lectina: mostra um diagrama que subarray cada amostra de soro e lectina foi aplicada sobre.
Imagens Figura 2. Microarray doamostra experimento 2 tela para fucosilação alteradas em glicoproteínas específicas como biomarcadores que discriminam cirrose hepática e pacientes com carcinoma hepatocelular. O ensaio de microarray foi realizada como descrito no Exemplo de secção Experiência 2. (A) A imagem do slide conjunto da lâmina de microarray a partir do Passo 8; (B) o diagrama da disposição anticorpo dentro de cada subarray; (C) mapas de matriz: a localização de cada anticorpo dentro do subarray, cada nome de anticorpo representa 3 pontos; (D) um zoom-in imagem de um subarray que foram incubadas com amostra de soro, (E) um zoom-in imagem de um subarray que foram incubadas com PBS de controlo.
Figura 3. Resultados da caracterização de glicanos exemplo de experimento 1. Cada gráfico de barras representam o perfil de lectina de ligação (ou perfis de glicano) de uma da proteína 20 testado. Total de 22 lectinas diferentes foram usados para analisar the perfil de glicano de cada proteína.
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Discussion
1. Proteína alvo e seleção anticorpo de captura
Antes do ensaio microarray anticorpo, alguns reagentes e materiais são necessários para ser considerado e preparado. Para conceber um microarray anticorpo para glicano perfil ou rastreio de glicano biomarcador, um painel de anticorpos específicos para os candidatos de glicoproteína deve ser determinada de acordo com a literatura ou a partir dos resultados anteriores. Esses anticorpos foram normalmente compradas de fornecedores diferentes, tais como R & D Systems etc IgGs são preferidos anticorpos de captura desde nossos testes anteriores mostraram que alguns IgM e IgE podem perder completamente suas afinidades de ligação ao antigénio após a modificação química.
2. Concepção e fabrico de microarray de anticorpos
Fabricação de microarray de anticorpos é um passo opcional que precisa microarrayer profissional e caro, e pessoal bem treinado para a operação. No entanto, personalizado anticorpo microarray fabricantetemperatura pode ser facilmente feito a partir de um prestador de serviços, tais como Serome Biosciences Inc. Para obter um resultado robusto, recomendamos uma microarrayer sem contato, como o volume de Scienion sciFLEXARRAYER ultra baixo sem contato microarrayer que foi usado em nossa fabricação microarray de anticorpos. Alta capacidade de ligação lâminas de microarray, como PATH (Gentel Bio Inc. WI) ou H Slide (Shott, PA).
3. Selecionar e preparar glicano Proteínas de Ligação (Gbps) para o perfil de glicosilação
GBPs que alvo diferente mono-ou oligossacáridos podem ser encontrados na literatura e através de um motor de pesquisa desenvolvido pelo laboratório Haab 29 e mantidas no Instituto translacional Genomics Para seleccionar GBPs com elevada especificidade e afinidade paraos epítopos glicano alvo, selecione o motivo (epítopo) a partir do menu drop-down, e clique em "pesquisar". O específico Gbps para este motivo (epítopo) serão listados de acordo com seu valor logP de alta para baixa ordem. Superior logP indica uma forte afinidade de ligação e especificidade para o tema glicano / epítopo. Devido ao problema não específica inerente de ligação de lectina, este método não é ainda como óptima como o ensaio de anticorpo com base. Assim, recomendamos que os anticorpos anti-glicano são utilizados, tais como anti-Lewis x ou anti-sialil Lewis alguns anticorpos, se eles estiverem disponíveis. Uso de GBPs múltipla para detecção é outra estratégia para cruzar diferentes perfis de ligação e de obter dados confiáveis de ligação.
4. A análise dos dados
Uma vez que este método é usado para detectar nativas proteínas do soro, os complexos proteína-proteína pode ser capturado e detectado. Western blot ou espectrometria de massa é bons métodos para validar os dados de microarrays. Entretanto, A detecção de níveis de proteína usando o mesmo microarray é outro método para aprender os detalhes da alteração de glicosilação da proteína, tais como se as alterações eram devidas à variação total nível de proteína ou apenas que o nível de glicosilação aumentada em cada uma das proteínas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Pesquisa de Vírus Hepatite e.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Biotinylated Concanavalin A | Vector Laboratories | BK-1000 | ConA |
Biotinylated Sambucus Nigra Lectin | Vector Laboratories | B-1305 | SNA |
Biotinylated Lens Culinaris Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | LCA |
Biotinylated Ricinus Communis Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | RCA |
Biotinylated Aleuria Aurantia Lectin | Vector Laboratories | B-1395 | AAL |
Biotinylated Erythrina Cristagalli Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | ECL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin II | Vector Laboratories | BK-3000 | GSL II |
Biotinylated Wheat Germ Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | WGA |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-E |
Biotinylated Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PHA-L |
Biotinylated Peanut Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | PNA |
Biotinylated Pisum Sativum Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | PSA |
Biotinylated Dolichos Biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | DBA |
Biotinylated Datura Stramonium Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | DSL |
Biotinylated Sophora Japonica Agglutinin | Vector Laboratories | BK-2000 | SJA |
Biotinylated Soybean Agglutinin | Vector Laboratories | BK-1000 | SBA |
Biotinylated Solanum Tuberosum (Potato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | STL |
Biotinylated Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories | BK-2000 | GSL I |
Biotinylated Vicia Villosa Lectin | Vector Laboratories | BK-2000 | VVL |
Biotinylated Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin | Vector Laboratories | BK-3000 | LEL |
Biotinylated Ulex Europaeus Agglutinin I | Vector Laboratories | BK-1000 | UEA I |
Biotinylated Jacalin | Vector Laboratories | BK-3000 | JACALIN |
Goat F(ab')2 Fragment anti-human IgM, Fc5μ antibody | Jackson Immuno Research | 109-006-129 | IgM |
Donkey F(ab')2 Frag anti-human IgG (H+L) antibody | Jackson Immuno Research | 709-006-149 | AB1 |
Mouse anti-human IgG F(ab')2 monoclonal antibody | Jackson Immuno Research | 209-005-097 | AB3 |
Goat anti-human alpha 2 macroglobulin polyclonal antibody | GeneTex | GTX62924 | A2M |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | Lee Biosiences | CA1T-80A | A1AT |
Mouse anti-human alpha-1-antitrypsin monoclonal antibody | Sigma-Aldrich | SAB4200198 | A1AT |
Rabbit anti-human alpha-1-antitrypsin polyclonal antibody | NeoMarkers | RB-367-A1 | ACT |
Rabbit anti-human alpha-1-antichymotrypsin polyclonal antibody | Fisher Scientific | RB9213R7 | ACT |
Mouse anti-human transferrin monoclonal antibody | GeneTex | GTX101035 | Transferrin |
Rabbit anti-human transferrin polyclonal antibody | GeneTex | GTX77130 | Transferrin |
Goat anti-human apolipoprotein J polyclonal antibody | Abcam | ab7610 | ApoJ |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | Abbott Laboratories | 14H4-23 | GP73 |
Mouse anti-human GP73 monoclonal antibody | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC | sc-101275 | GP73 |
Rabbit anti-human alpha-1 fetoprotein polyclonal antibody | GenWay | GWB-41C966 | AFP |
Mouse anti-human alpha-1 fetoprotein monoclonal antibody | Fitzgerald | 10-A05A | AFP |
Mouse anti-human hemopexin monoclonal antibody | Assaypro | 60190-05011 | Hemopexin |
Mouse anti-human glypican-3(1G12) monoclonal antibody | Santa Cruz Bio | sc-65443 | GPL3 |
Mouse anti-human Kininogen (LMW) monoclonal antibody | Assaypro | 20333-05011 | Kininogen |
Rabbit anti-human MMP-21 monoclonal antibody | Epitomic | 1955-1 | MMP21 |
Mouse anti-human CEACAM-1 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB1180 | CEACAM |
Rat anti-human DPPIV/CD26 monoclonal antibody | R&D Systems | MAB22441 | DPPIV |
Mouse anti-human PIVKA II monoclonal antibody | Crystal chem | 8040 | PIVICA |
Mouse anti-carcin–mbryonic antigen | US biological | C1300 | CEA |
Mouse anti-CA125 Cancer Antigen | US biological | C0050-01D | CA125 |
Mouse anti -CA19-9 Cancer antigen | US biological | C0075-18 | CA19-9 |
Mouse anti-Lewis x monoclonal antibody | Calbiochem | 434631 | Lewis X |
Biotinylated BSA (positive control) | Home-made | N/A | Bio |
Table 1. List of lectins and antibodies used in this protocol. | |||
Non contact microarrayer | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER | |
384 microplate | Fisher Scientific | 14-230-243 | |
FoodSaver | FoodSaver | V3835 | |
Ultrathin nitrocellulose coate microarray slides | Gentel | PATH | |
Slide Imprinter (optional) | The Gel Company | WSP60-1 | |
Shaker | Fisher Scientific | 15-453-211 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5804 000.013 | |
Slide washing basin/Slide Staining Dish with Removable Rack | Fisher Scientific | 08-812 | |
Slide incubation chamber/microscope slide box | Fisher Scientific | 03-448-5 | |
Brij 35, 30 w/v% solution in water | Acros Organics | AC32958-0025 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | P337-100 | |
Sodium Periodate (NaIO4) | Sigma-Aldrich | 311448 | |
L-Glutamic acid γ-hydrazide | Sigma-Aldrich | G-7257 | |
Sodium Acetate Anhydrous (CH3COONa) | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Biological Labs | 7500804 | |
Phosphate Buffer Saline (PBS) (10X) | Denville Scientific | CP4390-48 | |
Dylight 549 conjugated NeutrAvidin | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 22837 | |
Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Group | 4693159001 | |
ChromPure Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
ChromPure Mouse IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 015-000-008 | |
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 011-000-003 | |
ChromPure Donkey IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch | 017-000-003 | |
Microarray Scanner | Tecan Group Ltd. | LS Reloaded | |
Table 2. List of equipments and reagents used in this protocol. |
References
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