这里提出的直接PCR方法便于直接从少量的未精制的植物和动物组织的PCR扩增。
的直接PCR方法有利于PCR扩增直接从少量未纯化的样品,这里用于表明几种植物和动物组织( 图1)。直接PCR的基础上特别设计的赛默飞世尔科技Phusion Phire DNA聚合酶,其中包括双链DNA结合结构域,使他们独特的性能,如高耐受性抑制剂。
PCR为基础的目标DNA检测在植物研究中有许多应用,包括转基因植株基因型分析和验证。传统的PCR方法从植物组织中涉及的初始DNA分离步骤,这可能需要昂贵的或有毒的试剂。该过程是耗时的,并增加1,2的交叉污染的风险。相反,通过使用Thermo Scientific的Phire植物直接PCR试剂盒目标DNA可以被容易地检测到,没有现有的DNA提取。在该模型中表现出在这里,例如来自裂解的扩增多态性序列分析(dCAPS特异性)3,4进行直接从拟南芥的植物的叶子。可以使用dCAPS特异性基因分型分析,以确定由SNP等位基因特异的限制性核酸内切酶消化3的单核苷酸多态性(SNP)。
某些植物样品往往是更具挑战性的,当使用直接PCR方法,因为它们含有干扰PCR的组件,如酚类化合物。在这些情况下,需要一个额外的步骤,以除去该化合物是传统2,5。在这里,此问题被克服,通过使用一个快速和容易的稀释随后通过直接PCR扩增( 图1)的协议。作为一个具有挑战性的植物模型的样本含有大量的酚类物质,包括单宁酸,十五年的老橡树叶。
进行基因转移到小鼠中被广泛用于在开发与研究的作用的基因pment,生理与人类疾病。这些动物的使用需要筛选的转基因的存在,通常用PCR。传统上,这涉及一个耗时的DNA分离步骤中,在此期间,用于PCR分析的DNA纯化从耳,尾或脚趾组织6,7。然而,赛默飞世尔科技Phire动物组织直接PCR试剂盒的转基因小鼠进行基因分型,恕不另行DNA纯化。实现此协议中的转基因小鼠的基因分型的直接从小鼠耳组织,如这里用于显示其中只有一个引物组,用于扩增两个片段的大小差别很大的一个挑战性例子。
这里展示的直接PCR方法允许直接从少量未纯化的样品进行PCR扩增,减少所需要的时间,并简化为植物和动物的基因分型( 图7)的工作流程。此处也表现出与直接PCR的方法( 图3)是使用的稀释组合协议。困难的样品( 如老化植物的叶子,植物,含有干扰物质)或长(或富含GC),扩增产物稀释协议。时,开始一个新的直接PCR实验中,允许反应优化的,该协议是特别有用的。该协议可以作为一种工具来解决偶尔的困难,例如低的产品产率,由于在组织材料和/或使用的引物的差异。此外,运行多个反应时,从相同的样品,使用的稀释协议确保将整个样品在一个没有被消耗反应。
为了净化从植物中用于PCR的DNA,该公约来进行细胞裂解,然后由DNA分离使用各种部件,有可能会干扰PCR分析8。对于特别具有挑战性的植物与酚含量高,另外聚乙烯吡咯烷酮,传统上被用于删除与DNA结合的化合物,细胞裂解后的2,5。这里可以明显看出,这些复杂的,时间密集的步骤,可避免通过使用的Phire植物直接PCR试剂盒来检测目标DNA。使用的敏感dCAPS特异性技术直接从拟南芥的植物的叶子( 图2)的细胞裂解和DNA分离步骤可以省略。这里表明,稀释协议有效地管理问题的组件,可以干扰用聚合酶链反应( 图3)的存在下。
传统上,动物基因分型的先决条件是isolati通过一种有毒的,耗费时间的过程,其特征在于由一个漫长的孵化用蛋白酶K消化皮肤和结缔组织,其次通过有机溶剂提取,乙醇沉淀,并离心步骤6,9,10从动物组织中的基因组DNA上。这里表明,通过使用的Phire动物组织直接PCR试 剂盒来实现这个过程的简化,允许转基因小鼠进行基因分型,恕不另行DNA纯化( 图4)。在本文中演示的例子是特别具有挑战性,因为采用了大尺寸的差异,只有一个用于两个片段的扩增引物组。尽管协议的先天困难,使用直接PCR议定书简单稀释导致的两个PCR产物( 图4)的高收率的方法配合使用。
PCR为基础的目标DNA检测,有很多的应用研究,包括基因型分析,以确定发展,生理和疾病基因的角色。由于专门的DNA聚合酶抑制剂的耐受性,该协议可以在最短的时间,恕不另行DNA纯化完成。
The authors have nothing to disclose.
拟南芥的样品和有关PCR引物,我们感谢的JaakkoKangasjärvi教授和他的研究小组,的植物逆境集团,植物分子生物学,生物科学系,赫尔辛基大学。与传统方法的实验进行了夫人爱里Lamminmäki。
转基因小鼠提供样品,生物医学/生物化学研究所,赫尔辛基大学的博士JAANA Vesterinen。
哈里斯Uni-CORE核心和哈里斯切割垫的Shunderson通信公司的商标,所有其他商标的财产的Thermo Fisher Scientific公司及其附属公司的商标或注册商标。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Phire Plant Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-130 | 200 reactions (50 μl each) |
Phire Animal Tissue Direct PCR Kit | Thermo Fisher Scientific | F-140 | 200 reations (50 μl each) |
Harris Uni-Core 0.35 mm (pink) | Thermo Fisher Scientific | F-180S/L | Qty: 5/25 |
Harris Uni-Core 0.50 mm (blue) | Thermo Fisher Scientific | F-185S/L | Qty: 5/25 |
Harris Cutting Mat 6.4 × 7.6 cm | Thermo Fisher Scientific | F-190 | Qty: 5 |
SspI | Thermo Fisher Scientific | ER0771 | 100 μl (100 reactions) |
Piko 24-Well Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | TCP0024 | |
24-Well Piko PCR Plates | Thermo Fisher Scientific | SLP0241 | |
GeneJET PCR Purification Kit |
Thermo Fisher Scientific | K0701 K0702 |
50 preps 250 preps |