A qualidade de fibroblastos embrionários (MEFs) é ditada pela estirpe direito de rato tal como CF-1. Pluripotência-MEFs apoio e meios condicionados (CM), obtida a partir destes deve conter concentrações ótimas de Activin A, Gremlin e TGF-p1 necessários para a Activin / Nodal e vias FGF para co-operatório manter a auto-renovação e pluripotência.
Em geral, as células estaminais embrionárias (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs) 1 podem ser cultivadas sob condições variáveis. No entanto, não é fácil para estabelecer um sistema eficaz para a cultura dessas células. Uma vez que as condições de cultura pode influenciar a expressão do gene que confere pluripotência em hESCs e hiPSCs, a otimização e padronização do método de cultura é crucial.
O estabelecimento de linhas de células estaminais embrionárias humanas foi descrita pela primeira vez utilizando MEFs como células de alimentação e de soro fetal bovino (FBS)-2 contendo meio de cultura. Em seguida, foi substituído com FBS a substituição knockout soro (KSR) e FGF2, o que aumenta a proliferação de hESCs 3. Finalmente, os sistemas de alimentação de cultura sem permitir a cultura de células em Matrigel placas revestidas em KSR contendo meio condicionado (meio condicionado por MEFs) 4. Posteriormente, as condições de cultura hESCs se mudaram para alimentador de cultura livre em definidores quimicamentecondições ed 5-7. Além disso, para evitar a contaminação potencial por patógenos e métodos de animais proteínas de cultura utilizando xeno-free componentes foram estabelecidas 8.
Para se obter melhores condições células alimentadoras do rato foram substituídos com linhas de células humanas (por exemplo, músculo fetal e células da pele 9, as células adultas da pele 10, fibroblastos de prepúcio 11-12, amnióticas células mesenquimais 13). Contudo, a eficiência de manter hESCs indiferenciadas usando prepúcio humano camadas de fibroblastos derivados de alimentação não é tão elevada como a partir de células de ratinho de alimentação devido ao baixo nível de secreção de Activina A 14. Obviamente, há uma evidente diferença na produção de fator de crescimento pelo rato e células alimentadoras humanos.
A análise dos transcriptomas de rato e células alimentadoras humanos revelou diferenças significativas entre as células de apoio e não apoio. Exógena FGF2 é crucial para a manutenning auto-renovação das hESCs e hiPSCs, e tem sido identificada como um factor chave regulando a expressão de TGF-p1, Uma Activina e Gremlin (um antagonista de BMP) em células de alimentação. Activina A tem sido mostrado para induzir a expressão de Oct4, SOX2, e NANOG em hESCs 15-16.
Para a cultura de longo prazo, e hESCs hiPSCs podem ser cultivadas em MEFs mitoticamente inactivado ou sob condições isentas de alimentador em MEF-CM (MEF-meio condicionado) em Matrigel placas revestidas para manter o seu estado não diferenciado. Sucesso de ambas as condições de cultura depende inteiramente da qualidade das células de alimentação, uma vez que afecta directamente o crescimento de hESCs.
Aqui, nós apresentamos um método optimizado para o isolamento e cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs), a preparação de meio condicionado (CM) e enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) para avaliar os níveis de Activina A dentro dos meios de comunicação.
O processo de isolamento MEFs aqui apresentado permite o estabelecimento de uma condição de cultura padronizada para hESCs e hiPSCs. Além disso, o sistema de ELISA baseado utilizado para avaliar a produção de citocinas pelas células de alimentação é um indicador útil da qualidade dos meios de comunicação MEF derivados condicionados. A manutenção de rotina da estirpe de rato (CF1) proporcionando fibroblastos de suporte é necessário para evitar lote para lote variação de meios de cultura. Além disso, recomenda-se para isolar os embriões de ratinhos vários simultaneamente para se obter uma qualidade consistente de células. Certamente MEFs recentemente isolado pode ser mantido congelado a P0 e P1. MEFs também inactivado pode ser mantida congelada em alíquotas de quantidades apropriadas, dependendo dos requisitos para a cultura de células. Normalmente, aproximadamente 250,000 células devem ser revestida em um único poço de uma placa de 6 poços para hESCs cultura e células iPS. O método estabelecido e optimizado podendo ser utilizado rotineiramente para minimizar a variabilidade entre difealugar experimentos.
The authors have nothing to disclose.
Agradecimentos especiais ao Dr. Boris Greber para configurar o Activin Um protocolo de ELISA, publicada no Greber et al. De 2007. Estamos particularmente gratos à Sra. Monica Shevack para preparar a visão geral gráfica. Somos muito gratos ao Dr. Heiko Fuchs por toda a ajuda e sugestões valiosas, antes e durante as filmagens. Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Adjaye, especialmente Elisabeth Socha para manter um fornecimento constante de MEFs e CM. Reconhecemos também os nossos colegas no biotério do MPIMG por seu apoio permanente. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Sociedade Max Planck ea [BMBF; concessão 0315717A número], parceiros da iniciativa ERASysBio + apoiado no âmbito do EU ERA-NET Plus esquema no 7 º PQ.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
FBS | Biochrom | S0115 | |
L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
DMSO | Sigma | D2650 | |
Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
DNase I | Sigma | D4527 | |
Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |