La récolte macrophages alvéolaires murins et l'évaluation d'activation cellulaire induite par des nanoparticules polyanhydride
Summary
Ici, nous décrivons les protocoles pour la récolte des macrophages alvéolaires murins, qui sont des résidents cellules immunitaires innées dans le poumon, et en examinant leur activation en réponse à la co-culture avec des nanoparticules polyanhydride.
Abstract
Nanoparticules biodégradables ont émergé comme une plate-forme polyvalente pour la conception et la mise en œuvre de nouveaux vaccins par voie intranasale contre les maladies respiratoires infectieuses. En particulier, polyanhydride nanoparticules composé de l'acide sébacique aliphatique (SA), l'aromatique 1,6-bis (p-carboxyphénoxy) hexane (CPH), ou l'amphiphile 1,8-bis (p-carboxyphénoxy) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) afficher en vrac unique et cinétique d'érosion de surface 1,2 et peut être exploitée afin de libérer lentement biomolécules fonctionnelles (par exemple, les antigènes protéiques, des immunoglobulines, etc) in vivo 3,4,5. Ces nanoparticules possèdent également une activité adjuvante intrinsèque, ce qui les rend un excellent choix pour une plate-forme d'administration des vaccins 6,7,8.
Afin d'élucider les mécanismes qui régissent l'activation de l'immunité innée après la vaccination muqueuse nasale, il faut évaluer les réponses moléculaires et cellulaires de la p antigènecellules sentant (APC) responsables pour initier des réponses immunitaires. Les cellules dendritiques sont des APC principaux trouvés dans des voies aériennes, tandis que les macrophages alvéolaires (AMɸ) prédominent dans le parenchyme pulmonaire 9,10,11. AMɸ sont très efficaces dans l'élimination des poumons de pathogènes microbiens et 12,13 débris cellulaires. En outre, ce type de cellule joue un rôle important dans le transport d'antigènes microbiens vers les ganglions lymphatiques drainant, ce qui est une première étape importante dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative 9. AMɸ également exprimer des niveaux élevés de reconnaissance de formes innée et récepteurs éboueurs, sécrètent des médiateurs pro-inflammatoires, et les lymphocytes T 12,14. Une population relativement pure de AMɸ (par exemple, supérieure à 80%) peut être facilement obtenu par un lavage du poumon à l'étude dans le laboratoire. Resident AMɸ récoltées à partir de immunitaires des animaux compétentes de fournir un phénotype représentant des macrophages qui encounter le vaccin à base de particules in vivo. Ici, nous décrivons les protocoles utilisés pour la récolte et la culture AMɸ de souris et d'examiner le phénotype d'activation des macrophages après le traitement avec des nanoparticules polyanhydride in vitro.
Protocol
Discussion
Plates-formes de nanoparticules polyanhydride vaccins ont montré une efficacité lorsqu'il est administré par voie intranasale à des posologies à dose unique 5. Mesure de l'activation des cellules phagocytaires populations résidentes dans les poumons induites par cette plate-forme d'administration des vaccins permettant l'évaluation de sa capacité potentielle à terme, de promouvoir des réponses immunitaires adaptatives.
Plus précisément, la récolte des …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le US Army Medical Research et du matériel de commande (Numéros de subvention W81XWH-09-1-0386 et W81XWH-10-1-0806) pour un soutien financier et le Dr Shawn Rigby de la Facilité Iowa State University cytométrie en flux pour son assistance technique spécialisée.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| cAM Media | |||
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| 50 mM 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ML | |
| Penicillin/Streptomycin 10,000 μg/ mL Solution | Cellgro | 30-002-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FACS Buffer | |||
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | MK7868500 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217500 | |
| Potassium phosphate | Fisher Scientific | P288-200 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A7888 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Antibodies | |||
| Rat IgG | Sigma | I4341 | |
| Anti-Ms CD16/32 | eBioscience | 16-0161 | |
| Anti-Ms MHC II haplotype I-A/I-E, clone M5/114.15.2, conjugated to fluorescein isothiocyanate (FITC) | eBioscience | 11-5321 | |
| Anti-mouse CD86, clone GL-1, conjugated to allophycocyanin (APC)-Cy7 | Biolegend | 105030 | |
| Anti-mouse CD40, clone 1C10, conjugated to APC | eBioscience | 17-0401 | |
| Anti-mouse CD209, clone 5H10, conjugated to Biotin | eBioscience | 13-2091 | |
| Anti-mouse CD11b, clone M1/70, conjugated to Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0112 | |
| Anti-mouse F4/80, clone BM8, conjugated to phycoerythrin (PE)-Cy7 | eBioscience | 25-4801 | |
| PE-Texas red conjugated Streptavidin | BD Biosciences | 551487 | |
| Other Supplies and Reagents | |||
| Ethanol | Fisher Scientific | A405-20 | Used as 70% (v/v) |
| Compressed CO2 | Linweld | 16000060 | |
| 1 mL Syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| Sovereign 3 ½” Fr Tom Catcatheter | Kendall | 703021 | |
| Biosafety Cabinet | NUAIRE | Series 22 | |
| Dissection Scissors | Fisher | 138082 | |
| Forceps | Roboz | RS-8254 | |
| PBS, 1X without calcium and magnesium | Cellgro | 21-040-CM | |
| 15 mL Centrifuge Tubes with Screw Cap | VWR International | 21008-216 | |
| Six-well Tissue Culture Treated Plates | Costar | 3516 | |
| Plastic Tube Racks | Nalgene | 5970 | |
| Cell Scraper 24 cm | TPP | 99002 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube | Falcon | 352008 | |
| Pipet-aid XL | Drummond | 4-000-105 | |
| 10, 5, and 2 mL Pipettes | Fisher | 13-675 | |
| 200 and 10 μL micropipettors | Gilson Pipetman | F123601 | |
| 200 and 10 μL pipette tips | Fisher | 02-707 | |
| BD Stabilizing Fixative | BD Biosciences | 338036 | |
| Isoton II Diluent | Beckman-Coulter | 8546719 | |
| Zap-oglobin II Lytic Reagent | Beckman-Coulter | 7546138 | |
| Coulter Counter Polystyrene Vials | Beckman-Coulter | 14310-684 | |
| Test Tubes | BD Biosciences | 352008 | |
| Equipment | |||
| Refrigerated Centrifuge | Labnet | 50075040 | |
| Humidified Incubator CO2 | Nuaire | Model Autoflow 8500 | |
| FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | 338960 | |
| Coulter Particle Counter Z1 | Beckman-Coulter | WS-Z1DUALPC | |
| Sonicator Liquid Processing Equipment with Microtip | Misonix | Model No. S-4000 |
Riferimenti
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