Nanodiscs fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine membran proteinleri dahil küçük diskoid parçacıklardır. Biz bir disk içine MalFGK2 taşıyıcı adım adım kuruluş gösteren görsel bir protokol sağlar.
Nanodisc bir diskoidal parçacık (~ 10-12 nm büyük) o tuzağa membran proteinlerinin fosfolipid çift tabakası küçük bir yama içine. Olduğunu Nanodisc özellikle ligand-reseptör etkileşimlerinin bağlamında, zar proteinleri çalışmak için özellikle çekici bir seçenek. Yöntem Sligar tarafından ve arkadaşları, apolipoprotein A1 türetilen bir tasarlanmış çok a-sarmal iskele protein amfipatik özelliklerine dayanmaktadır. Kutup bölgeleri sulu ortamda karşı karşıya iken iskele proteinin hidrofobik yüzleri iki tabakalı lipid ve yağ açil yan zincirleri ile etkileşim. Partikülleri, küçük homojen değildir ve suda çözünebilir olduğu için nanodiscs içinde zar proteinlerinin analizi lipozom göre önemli avantajlara sahiptir. Buna ek olarak, normal olarak çözünür proteinler için ayrılmış biyokimyasal ve biyofiziksel uygulanan yöntemler, ve zarın her iki tarafında olabilir. Bu görsel protokol, biz iyi bir karakter bir adım-adım sulandırma sunmakkarekterize bakteriyel ABC taşıyıcı, erkek-MalFGK 2 kompleksi. Diskin oluşum deterjan ilerleyen çıkarılması sırasında meydana gelen hidrofobik etkileşimler bağlı olarak bir öz montaj işlemdir. Biz gerekli adımları açıklamak ve agrega ve büyük polidispers lipozom benzeri partiküllerin oluşumunu sınırlamak için doğru protein-to-lipid oranı seçmenin önemini vurgulamak. Basit kalitesi tür diskler düzgün sulandırılmış oylandı emin jel filtrasyon kromatografisi, yerli jel elektroforezi ve dinamik ışık saçılma spektroskopisi olarak denetler.
Biz nanodiscs içine maltoz taşıyıcı sulandırılması için basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taşıyıcı ATPaz aktif ve çözünen bağlayıcı ortağı erkek ile etkileşim (Şekil 3) yeniden olabilir. Nanodiscs içine taşıyıcı başarılı rekonstitüsyon ek biyofiziksel ve biyokimyasal analiz için yolu açın. Özellikle ilgi Of Malk ATPaz ve deterjan maltoz taşımacılık faaliyeti, lipozom ve nanodiscs sistematik analiz olacaktır. ABC taşıyıcıları taşıma döngüsü sıras?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. CSC Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi doktora sonrası burs tarafından finanse edildi. FD bir Tier II Kanada Araştırma Başkanı olduğunu.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||
Amicon Ultra-4 50K centrifugal filter | Millipore | UFC805008 | Follow manufacturer’s protocol for proper use | ||||||||||||||||||||||||||||||
Bio-Beads SM-2 Adsorbent | Bio-Rad | 152-3920 | |||||||||||||||||||||||||||||||
E. coli total lipids | Avanti Polar Lipids | 100500C | Dissolved in chloroform, handle as appropriate for an organic solvent | ||||||||||||||||||||||||||||||
Ni sepharose HP resin | GE Healthcare | 17-5268-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Phosphorous standard solution | Sigma-Aldrich | P3869 | |||||||||||||||||||||||||||||||
pMSP1D1 | Addgene | 20061 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare | 17-5172-01 | |||||||||||||||||||||||||||||||
Table I. Specific reagents. | |||||||||||||||||||||||||||||||||
|