Identifizierung und Isolierung von Slow-teilenden Zellen im menschlichen Glioblastoma Mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
Summary
Diese Video-Protokoll zeigt die Anwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) zur Identifikation und Trennung von verschiedenen Subpopulationen von Zellen in humanen Glioblastomzellen nach der Häufigkeit des Zellteilung basiert.
Abstract
Tumorheterogenität stellt eine grundlegende Funktion tragenden Tumor Robustheit und stellt eine zentrale Hindernis für die Entwicklung von therapeutischen Strategien ein. Um das Problem der Tumorheterogenität zu überwinden, ist es wichtig, Tests und Tools ermöglichen phänotypische, (epi) genetische und funktionelle Identifizierung und Charakterisierung von Tumor-Subpopulationen, die spezifische Krankheit Krankheiten zu fahren und stellen klinisch relevante Ziele zu entwickeln. Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass Tumore unterschiedlichen Sub-Fraktionen von Zellen mit unterschiedlichen Frequenzen der Zellteilung zeigen, und dass die funktionalen Kriterien der langsamen Rad positiv mit Tumorbildung Fähigkeit in mehreren Krebsarten einschließlich des Gehirns, der Brust, der Haut und die damit verbundenen Bauchspeicheldrüse sowie Leukämie 2-8. Der Fluoreszenzfarbstoff Carboxyfluorescein-succinimidylester (CFSE) hat zum Verfolgen der Teilung Häufigkeit von Zellen in vitro und in vivo im Blut übertragbaren t verwendetumors und soliden Tumoren wie zB Glioblastoma 2,7,8. Das Zell-permeierenden nicht fluoreszierenden Prodrug CFSE wird durch intrazelluläre Esterasen in eine fluoreszierende Verbindung, die innerhalb der Zellen durch kovalentes Binden an Proteine durch Reaktion seiner Succinimidyl-Komponente mit intrazellulären Amingruppen zu bilden stabile Amidbindungen 9 zurückgehalten wird umgewandelt. Der Fluoreszenzfarbstoff wird gleichmäßig zwischen Tochterzellen auf Bereiche verteilt werden, was zu einer Halbierung der Fluoreszenzintensität mit jeder Zellteilung. Dies ermöglicht die Verfolgung von Zellzyklus Frequenz von bis zu 8-10 Runden Teilung 10. CFSE Rückhaltevermögen wurde mit Hirntumorzellen zur Identifizierung und Isolierung eines langsamen Rad Subpopulation (obere 5% Farbstoff haltenden Zellen) nachgewiesen, bei Krebs Stammzellaktivität 2 angereichert werden.
Dieses Protokoll beschreibt die Technik der Färbung von Zellen mit CFSE und die Isolierung einzelner Populationen innerhalb einer Kultur von menschlichen GlioBlastom (GBM)-abgeleiteten Zellen mit unterschiedlichen Teilungsraten mittels Durchflusszytometrie 2. Die Technik hat dazu gedient, zu identifizieren und zu isolieren, einen Hirntumor slow-cycling Population von Zellen, die aufgrund ihrer Fähigkeit, die CFSE Kennzeichnung erhalten.
Protocol
Discussion
Eine wachsende Zahl von Studien haben die Bedeutung eines langsamen teilende Unterabteil von Zellen in Krebszellen, die Tumorbildung und Therapieresistenz 2-8 beitragen demonstriert. Daher ist es wichtig, zu beschreiben und zu standardisieren experimentellen Methoden, mit denen das Studium dieser spezifischen Subpopulation von Zellen oder mehr allgemein Subpopulationen mit unterschiedlichen Wachstumsraten vergleichen. Mit CFSE zu identifizieren und zu isolieren, Sub-Fraktionen von Zellen auf ihre Rate der Zel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Florida Center for Brain Tumor Research, Preston A. Wells Jr. Center for Brain Tumor Therapie und den National Institutes of Health (1R21CA141020-01) unterstützt.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
Riferimenti
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
