Karboksi Flöresein sukkinimidil ester (KAKE) Kullanarak İnsan Glioblastoma Yavaş-bölme Hücreleri Tanımlama ve İzolasyonu
Summary
Bu video protokol hücre bölünmesi sıklığına göre insan glioblastoma hücreleri farklı alt-popülasyonlarının belirlenmesi ve ayrılması için floresan boya carboxyfluorescein sukkinimidil ester (KAKE) uygulamasını gösterir.
Abstract
Tümör heterojenite tümör sağlamlığı destekleyen temel bir özelliği temsil eder ve tedavi stratejilerinin 1 gelişiminde merkezi bir engel koymaktadır. Tümör heterojenliğin sorunu aşmak için, belirli bir hastalığın patolojiler sürücü ve klinik hedefleri temsil tümörün alt popülasyonlarının fenotipik, (epi) genetik ve fonksiyonel belirlenmesi ve tanımlanması sağlayan deneyleri ve araçlar geliştirmek esastır. Bu, şimdi de tümörleri yavaş bisiklet olma fonksiyonel kriterleri pozitif tümör oluşumu beyin, göğüs, cilt de dahil olmak üzere çeşitli kanser yeteneği ile ilişkili olduğu hücre bölünmesi, farklı frekanslarda bulunan hücrelerin alt fraksiyonlar ayrı göstermektedir ve olduğunun tespit edilmesi pankreas yanı sıra lösemi 2-8. Floresan boya carboxyfluorescein süksinimidil ester (CFSE) kan yoluyla in vitro olarak T hücrelerinin bölünmesini frekans izlemek için ve in vivo olarak kullanılmıştırumors ve bu glioblastoma 2,7,8 gibi solid tümörler. CFSE, hücre-geçirgenler floresan olmayan pro-ilaç kararlı amid bağı oluşturmak üzere hücre içi 9 amin grupları ile süksinimidil kısmının reaksiyon yoluyla proteinlere kovalent olarak bağlanarak hücre içinde tutulan bir floresan bileşik, içine hücre içi esterazlar ile dönüştürülür. Floresan boya eşit her hücre bölünmesi ile floresans şiddetinin ikiye bölme neden bölünmeler üzerine kızı hücreleri arasında dağıtılır. Bu bölünme 10 sekiz ila on mermi kadar hücre döngüsü frekans izleme sağlar. KAKE tutma kapasitesi kanseri kök hücre aktivitesi 2 zenginleşmektedir gösterdi yavaş bisiklet subpopülasyonu (üst% 5 boya tutucu hücreleri) belirlemek ve yalıtmak için beyin tümör hücreleri ile birlikte kullanılmıştır.
Bu protokol, insan glio kültürü içinde KAKE ile boyanan hücrelerin tekniği ve bireysel nüfus izolasyonu açıklarblastom (GBM)-türetilen akım sitometri 2 kullanarak farklı bölünme fiyatla sahip hücreler. Tekniği tanımlamak ve KAKE etiketleme korumak için onların yeteneği sayesinde hücrelerin beyin tümörü yavaş bisiklet nüfusu izole etmeye hizmet etmiştir.
Protocol
Discussion
Çalışmalar artan bir sayıda tümör oluşumunu ve tedavi direnç 2-8 katkı kanser hücrelerinin bir yavaş alt bölme bölümünün önemini ortaya koymuştur. Bu nedenle, farklı büyüme oranları ile subpopülasyonunun karşılaştırmak için daha genel olarak hücre ya da bu belirli alt populasyonun çalışma deneysel sağlayan yöntemleri açıklanmaktadır ve standartlaştırmak için çok önemlidir. Hücre bölünmesi onların oranı esas alınarak hücre alt fraksiyonlarının belirlemek ve ya…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Beyin Tümörü Araştırma, Beyin Tümörü Tedavi ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (1R21CA141020-01) Preston A. Wells Jr Merkezi Florida Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Tipo | Company | Catalogue number |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | Gibco | 25300-062 |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma | T6522 |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140-122 |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Falcon | 352070 |
| EGF | Growth factor | R&D | 2028-EG |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Fluorescent Cell Division Tracking Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
Riferimenti
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-1343 (2011).
- Krishnamurthy, K., Wang, G., Rokhfeld, D., Bieberich, E. Deoxycholate promotes survival of breast cancer cells by reducing the level of pro-apoptotic ceramide. Breast Cancer Res. 10, 106-106 (2008).
- Pece, S. Biological and molecular heterogeneity of breast cancers correlates with their cancer stem cell content. Cell. 140, 62-73 (2010).
- Roesch, A. A temporarily distinct subpopulation of slow-cycling melanoma cells is required for continuous tumor growth. Cell. 141, 583-594 (2010).
- Dembinski, J. L., Krauss, S. Characterization and functional analysis of a slow cycling stem cell-like subpopulation in pancreas adenocarcinoma. Clin. Exp. Metastasis. 26, 611-623 (2009).
- Graham, S. M. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. Blood. 99, 319-325 (2002).
- Holyoake, T. L. Primitive quiescent leukemic cells from patients with chronic myeloid leukemia spontaneously initiate factor-independent growth in vitro in association with up-regulation of expression of interleukin-3. Blood. 97, 720-728 (2001).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Azari, H. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633-e3633 (2011).
- Azari, H. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
