Questo protocollo video dimostra l'applicazione del colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) per l'identificazione e la separazione di differenti sottopopolazioni di cellule di glioblastoma umano basati sulla frequenza di divisione cellulare.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Identificazione e isolamento di Slow-divisione delle cellule nel glioblastoma umano per mezzo di Carboxy fluoresceina succinimidile Ester (CFSE)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Eterogeneità tumorale rappresenta una caratteristica fondamentale di supporto robustezza tumore e presenta un ostacolo centrale per lo sviluppo di strategie terapeutiche 1. Per superare il problema della eterogeneità tumorale, è essenziale sviluppare saggi e strumenti che consentono fenotipica, (epi) identificazione genetica e funzionale e caratterizzazione di sottopopolazioni tumorali che guidano patologie malattie specifiche e rappresentano obiettivi clinicamente rilevanti. È ormai noto che i tumori esporre distinti sotto-frazioni di cellule con differenti frequenze di divisione cellulare, e che i criteri funzionali essendo ciclo lento è correlata positivamente con capacità di formazione di tumori in diversi tumori inclusi quelli del cervello, la mammella, della pelle e pancreas così come la leucemia 2-8. Il colorante fluorescente carbossifluoresceina succinimmidil estere (CFSE) è stato utilizzato per il monitoraggio della frequenza di divisione delle cellule in vitro e in vivo in ematica tumors e tumori solidi come il glioblastoma 2,7,8. La cellula-permeant non fluorescente pro-farmaco di CFSE viene convertito da esterasi intracellulari in un composto fluorescente, che è trattenuta all'interno delle cellule da covalentemente legame alle proteine per reazione della sua porzione succinimidil con gruppi amminici intracellulari di formare legami ammidici stabili 9. Il colorante fluorescente è equamente distribuito tra cellule figlie upon divisioni, portando alla dimezzamento dell'intensità di fluorescenza con ogni divisione cellulare. Ciò consente il monitoraggio della frequenza del ciclo cellulare fino a otto-dieci giri di divisione 10. Capacità di ritenzione CFSE è stato utilizzato con le cellule tumorali del cervello per identificare e isolare una sottopopolazione lento in bicicletta (top 5% dye-fissaggio celle) ha dimostrato di essere arricchito in attività delle cellule staminali del cancro 2.
Questo protocollo descrive la tecnica di colorazione delle cellule con CFSE e l'isolamento di singole popolazioni in una cultura umana glioblastoma (GBM) derivati da cellule che posseggono differenti tassi di divisione in citometria a flusso 2. La tecnica è servito per identificare e isolare un tumore lento ciclismo popolazione di cellule cerebrali in virtù della loro capacità di trattenere l'etichettatura CFSE.
Protocollo
1. Preparazione sospensione singola cella Glioblastoma
- Cultura Gliomasphere è stabilito e mantenuto con il dosaggio neurosfere (NSA), come descritto in precedenza 2,11,12.
- Al momento opportuno per passaging le gliomaspheres, il terreno contenente le sfere viene rimosso, collocato in un apposito tubo di tessuto sterile cultura dimensioni, e centrifugati a 800 rpm (110 g) per 5 min a temperatura ambiente.
- Il supernatante viene scartato e il pellet di sfere viene risospeso in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA e incubate a 37 ° C in un bagno di acqua per 3-5 min.
- Un volume uguale di inibitore della tripsina di soia viene poi ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Un numero crescente di studi hanno dimostrato l'importanza di una lenta separazione sub-compartimento di cellule nel cancro che contribuiscono alla formazione di tumori e di resistenza al trattamento 2-8. Pertanto è fondamentale per descrivere e standardizzare metodi sperimentali che consentano lo studio di questa sottopopolazione di cellule o più in generale per confrontare sottopopolazioni con differenti tassi di crescita. Utilizzando CFSE per identificare e isolare sotto-frazioni di cellule in base al .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro per la Ricerca Florida Tumore al cervello, il Preston A. Wells Jr. Centro per la Terapia Tumore al cervello e il National Institutes of Health (1R21CA141020-01).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Tipo | Azienda | Numero di catalogo |
| NeuroCult NSC media basale (umano) | Medio | Stem Cell Technologies | 05750 |
| NeuroCult NSC Supplementi proliferazione (umano) | Supplemento Media | Stem Cell Technologies | 05753 |
| 0,05% tripsina-EDTA | Reagente | Gibco | 25300-062 |
| Inibitore della tripsina di soia | Reagente | Sigma | T6522 |
| Penicillina / streptomicina | Reagente | Gibco | 15140-122 |
| T25 pallone | Cultura ware | Nalge Nunc internazionale | 136196 |
| T80 pallone | Cultura ware | Nalge Nunc internazionale | 178905 |
| 15 ml provette | Cultura ware | BD Falcon | 352096 |
| 50 ml provette | Cultura ware | BD Falcon | 352070 |
| FEG | Fattore di crescita | R & S | 2028-EG |
| CellTrace CFSE cellulare Kit proliferazione | Cell Division fluorescente monitoraggio Dye | Molecular Probes, Invitrogen | C34554 |
Riferimenti
- Tian, T., Olson, S., Whitacre, J. M., Harding, A. The origins of cancer robustness and evolvability. Integr. Biol. (Camb). 3, 17-30 (2011).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134 (Pt. 5), 1331-....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
