在OVO在鸡胚中脑多巴胺神经元发育中的基因功能研究电穿孔
Summary
评估的功能和在发展中脑多巴胺能神经元的基因调控，我们描述了一种方法，涉及<em>在OVO</em>鸡胚腹侧中脑多巴胺能神经元祖细胞质粒DNA结构的电。这种技术可以用来实现感兴趣的基因的高效表达，以研究脑发展和多巴胺神经元分化的不同方面。
Abstract
多巴胺能神经元位于中腹脑控制的运动，情绪化的行为，和奖励机制1-3。腹侧中脑多巴胺神经元功能障碍是帕金森氏症，精神分裂症，抑郁症，老年痴呆症1-5牵连。因此，研究中脑多巴胺神经元分化的调节不能只提供重要的洞察到调节脑发育和神经祖命运规范机制，而且还有助于开发治疗多种人类神经系统疾病的新的治疗策略。
多巴胺神经元分化从排队心室胚胎腹侧中脑区的神经祖细胞。神经祖细胞的发展，控制基因表达方案6,7。在这里，我们报告技术利用电汉堡汉密尔顿（HH）阶段11脑基因表达（THirteen体节，42小时）鸡胚8,9。允许在特定的萌芽阶段的实验操作方便，在后来的发展时间点10-13决定的影响，的鸡胚外部发展。鸡胚早期阶段，13（19体节，48小时）超过HH神经管组成的具有多能分化成不同类型的细胞神经系统的神经祖细胞。的pCAG载体，其中包含CMV启动子和小鸡β-actin的增强，使强大的标志或其他抗原标记的鸡胚神经管14结构表达。在这份报告中，我们强调特别措施，以实现区域限制的基因表达，在胚胎中脑多巴胺能神经元祖细胞，包括如何注入DNA构建专门的胚胎中脑区域，以及如何针对小定制电极电。分析C希克在稍后阶段的脑体内质粒载体介导的增益功能和亏损的功能研究脑发展系统提供一个很好的。实验系统的改造，可以延长该法执行的命运映射分析和研究基因表达调控神经系统的其他部分。
Protocol
Discussion
在鸡胚脑OVO电提供了一种低成本，快速的替代代转基因或基因敲除动物在中脑多巴胺神经元发育基因的功能进行的体内实验研究。使用短2毫米长L形的铂电极与胚胎脑特异的DNA注入是实现高效的兴趣在中脑多巴胺能神经元祖细胞的基因表达的关键。此外，使用正确的农户阶段11鸡胚是至关重要的。这是因为，第一，在农户阶段11，鸡脑的发展是不够先进等，前脑，中脑，后脑形…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢孝彦松田博士提供pCAG-mCherry建设。陶博馆的支持由从Schweppe基金会事业发展奖“，从白厅基金会的资助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Fertilized chicken eggs | Charles River Laboratories | ||
| Egg incubator | GQF Manufacturing | 1502 Sportsman | |
| BTX Electroporator | BTX Harvard Apparatus | ECM830 | |
| Electrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0162 L-shaped genetrodes | For use with ECM830 electroporator |
| Platinum iridium wire | Alfa Aesar | #10056 | 0.5 mm diameter For making the 2 mm long electrodes |
| Glass capillary tube | World Precision Instrument | TW100F-4 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| India ink | Staples | Filter 20% before use | |
| Microinjector | Parker Automation, Parker Hannifin Cooperation |
Picospritzer III | |
| Fluorescent dissection microscope | Leica | MZ16F | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument | D-97 |
Riferimenti
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with ‘reward’. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci. 22, 3306-3311 (2002).
- Moore, D. J., West, A. B., Dawson, V. L., Dawson, T. M. Molecular pathophysiology of Parkinson’s disease. Annu. Rev. Neurosci. 28, 57-87 (2005).
- Dailly, E., Chenu, F., Renard, C. E., Bourin, M. Dopamine, depression and antidepressants. Fundam. Clin. Pharmacol. 18, 601-607 (2004).
- Sesack, S. R., Carr, D. B. Selective prefrontal cortex inputs to dopamine cells: implications for schizophrenia. Physiol. Behav. 77, 513-517 (2002).
- Ang, S. L. Transcriptional control of midbrain dopaminergic neuron development. Development. 133, 3499-3506 (2006).
- Andersson, E. Identification of intrinsic determinants of midbrain dopamine neurons. Cell. 124, 393-405 (2006).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A Series of Normal Stages in the Development of the Chick Embryo. J. Morphol. 88, 49 (1951).
- Bellairs, R., Osmond, M. . The atlas of chick development. , (2005).
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. ‘Shocking’ developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).
- Momose, T. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Nishi, T. High-efficiency in vivo gene transfer using intraarterial plasmid DNA injection following in vivo electroporation. Cancer Res. 56, 1050-1055 (1996).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16-22 (2004).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408 (2007).
- Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39, 73-78 (2004).
