RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em> 현장에서</em> 하이브리드 (물고기)
1Centre for Medical Parasitology, Department of International Health, Immunology & Microbiology, Faculty of Health Sciences,University of Copenhagen, 2Department of Infectious Diseases,Copenhagen University Hospital (Rigshospitalet), 3Institute of Infection and Immunology Research, School of Biology,University of Edinburgh
Summary
형광성의<em> 현장에서</em개별 셀의 mRNA 성적 증명서를 확인하는> 하이브리드 (물고기) 등의 하나 이상의 회원의 동시 전사로 polygenic 활동의 분석을 할 수 있습니다<em> VAR</em> multigene 가정에서<em> Plasmodium falciparum</em> 감염된 적혈구<sup> 1</sup>. 기술은 적응력이 있으며, 유전자, 세포와 생물의 다른 유형에 사용할 수 있습니다.
Abstract
말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다.
haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE 1.
여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA – 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 2 (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 – 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.
Protocol
1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성 PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 1 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다. 1 일 P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800…
Representative Results
그림 1은 주요 단계와 RNA 물고기 방법론의 시간 기간의 순서도를 보여줍니다. 단일 P.를 사용하여 잘하고 제대로 보존 스테인드 mRNA 생선 실험을 대표하는 일련의 이미지 falciparum IE는 그림 2에 표시됩니다. 이 세포 protozoan는 DAPI와 푸른 물들어있는 작은 (1-1.5 μm 직경) 핵이 있습니다. 배란 후 24 시간 P.의 적혈구 침공 후 falciparum?…
Discussion
RNA 물고기 분석 등 북부 blotting과 RT-PCR 등의 방법에 대조적으로, 단일 세포 수준에서 특정 mRNA의 성적 차별을 할 수 있습니다. 이 P.,이 예에서는이 가능 transcriptionally 운영 중 및 운영 중지 세포 구별 할 수 있습니다 falciparum은 기생 인간의 적혈구 내부 원생 동물. 이러한 모든 세포 관찰은 종종 필요하고 중요하고 새로운 전사 패턴에게 1 낼 수 있습니다.
?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 우수한 기술 지원을 위해 기생충과 크리스티나 Holm이의 genotyping을 위해 마이클 Alifrangis과 Ulla Abildtrup 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (보조금 55,005,511), Lundbeck 재단 (부여 R9-A840)와 닐스 Bohr 국제 교류 재단이 지원되었습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Acetic Acid | Sigma/Aldrich | 338826-100ml | |
| Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution |
| Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution |
| Albumax-solution: Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9377 | 0.8 g Hypoxanthine |
| Albumax-solution: AlbuMAX II | Invitrogen | 11021-037 | 200 g Albumax |
| Albumax-solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Amberlite | Sigma | A5710-110G | Resin to deionize formamide. |
| Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate | Calbiochem | 203206 | |
| Anti-Dig antibody | Novus biologicals | NB100-41330 | |
| Anti-fade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely. |
| Biotin RNA Labeling Mix | Roche | 11685597910 | |
| Camera digital | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Coverslips | Menzel-glaser | 631-1570 | |
| culture flask 25 cm2 Nunclon surface | Nunc | 156340 | |
| DEPC | Fluka/Sigma | 32490-100ml | 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min. |
| Digital camera | Nikon digital sight DC-F11 | ||
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10002D | |
| DynaMaq-15 Magnet | Invitrogen | 123-01D | |
| Formamide bioultra 99 % | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper. |
| Gelatine 0.75% solution: Gelatine | Sigma-Aldrich | G2500 | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 | Lonza | BE12-115F | 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: L-glutamin | Sigma-Aldrich | G3126 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Glutamine solution: HCl | Sigma | H1758 | 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots. |
| Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x | Fluka/Sigma | 47671-1l-F | Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots 10 ml deionized formamide |
| Hybridization solution: Denhardt’s 50x concentrate | Sigma | D2532 | 5 ml 20xSSC |
| Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent | Sigma | R-6750 | 2 ml 50x Denhardt’s 250 μl 20 mg per ml yeast tRNA |
| Hybridization solution: Salmon sperm DNA | Fluka/Sigma | 31149-106GF | 0.4 g Roche blocking reagent 1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution) |
| Hybridizer ThermoStar 100 HC4 | Quantifoil Instruments GmbH | 1004-0011 | Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water. |
| Immersion oil UV transparent fluorescence free | Sigma | 10976-1EA | |
| Immunofluorescence or confocal microscope | Nikon D-Eclipse TE2000C | ||
| Nailpolish | Available in any drugstore | ||
| PBS 20x:NaCl
KCl Na2HPO4 x 2H2O KH2PO4 DEPC deionized H2O |
Ajust pH to 7.4
160 g 4 g 23 g 4 g 1 l |
||
| Paraformaldehyde 4 % | Fluka/chemika | 76240 | 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % | 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid | ||
| Pepsin | Sigma/Aldrich | P7000 | |
| Peroxidase-conjugated anti-biotin | Calbiochem | 203206 | |
| RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution | Lonza | BE12-115F | 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution |
| RBC-wash media: Gentamycin sulfate | Lonza | BE02-012E | 2.5 ml gentamycin sulphate |
| RNase | Sigma/Aldrich | Make a 10 mg/ml stock solution. | |
| RNase free 1.5 ml tube | Ambion | AM12450 | |
| RNase Zap | Ambion | AM9780 | |
| Slides 4 wells 11 mm | Thermo Scientific | MENZXER306W | |
| SSC 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSC 20x: Sodium citrate dehydrate | Sigma/aldrich | W302600 | 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl |
| SSPE 20x: NaCl | Sigma/Aldrich | S9625 | 175.3 g NaCl |
| SSPE 20x: NaH2PO4 | Sigma/Aldrich | S0751 | 27.6 g NaH2PO4. |
| SSPE 20x:4 EDTA powder | 9.4 g EDTA powder Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min |
||
| TNB buffer: TNT buffer | 10 ml TNT buffer | ||
| TNB buffer: Blocking reagent | 0.05 g Blocking reagent To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
||
| TNT buffer: Tris/HCl | Sigma | T1503 | 1M Tris/HCl, pH 8.0 |
| TNT buffer: NaCl | Sigma Aldrich | S9625 | 100 ml |
| TNT buffer: Tween20 | Sigma | 93773 | 5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH2O 869 Ml Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.) |
| TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system | Perkin Elmer | NEL753000IKT | Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment. |
| Tubes 14 ml sterile | Almeco – CM LAB Aps | 91016 |
Riferimenti
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- Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).
Tags
Single-cell Gene TranscriptionRNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)Plasmodium Falciparum Infected ErythrocytesPfEMP1 Protein VariantsVar GenesMutually Exclusive RegulationTranscription AssaysRNA-FISH MethodologyDigoxigenin-labeled Antisense RNA ProbesBiotin-labeled Antisense RNA ProbesTSA Plus Fluorescence Palette System
Citazione di questo articolo
Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).