Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)
Summary
Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.
Abstract
Las interacciones entre las células y su microambiente circundante tienen consecuencias funcionales para el comportamiento celular. En el nivel de células individuales, distintos microambientes puede imponer diferenciación, migración, proliferación y fenotipos, y en el nivel de los tejidos del microambiente procesos tan complejos como la morfogénesis y la tumorigénesis 1. No sólo el contenido celular y molecular de las células impacto microambientes dentro, pero también lo hacen la elasticidad 2 y 3 de la geometría del tejido. Se define como la suma total de la célula-célula, ECM-, y solubles en interacciones de los factores, además de las características físicas, el microambiente es complejo. Los fenotipos de las células dentro de un tejido son parcialmente debido a su contenido genómico y parcialmente debido a las interacciones combinatorias con el microenviroment. Un reto importante es vincular las combinaciones específicas de componentes microambientales con comportamientos distintivos.
ent "> A continuación, presentamos el microambiente de microarrays (MEArray) plataforma de base de células de cribado funcional de las interacciones con los microambientes combinatorias 4. El método permite el control simultáneo de la composición molecular y el módulo de elasticidad, y combina el uso de microarrays ampliamente disponible y tecnologías micropatterning. pantallas MEArray requieren tan pocos como 10.000 células por matriz, lo que facilita los estudios funcionales de tipos de células raras, tales como células progenitoras adultas. Una limitación de la tecnología es que microambientes enteros de tejido no puede ser completamente recapitulado en MEArrays. Sin embargo, la comparación de los respuestas en el mismo tipo de célula a numerosos microambientes relacionados, por ejemplo combinaciones pareadas de proteínas ECM que caracterizan un tejido dado, se proporciona una visión de cómo los componentes microambientales obtener tejidos específicos de fenotipos funcionales.MEArrays se puede imprimir utilizando una amplia variedad de gro recombinantefactores wth, citoquinas, y proteínas purificadas ECM, y sus combinaciones. La plataforma está limitada sólo por la disponibilidad de reactivos específicos. MEArrays son susceptibles de tiempo-caducada análisis, pero más a menudo se utilizan para el análisis de punto final de las funciones celulares que son medibles con sondas fluorescentes. Por ejemplo, la síntesis de ADN, la apoptosis, la adquisición de estados diferenciados, o la producción de productos génicos específicos se miden comúnmente. En pocas palabras, el flujo básico de un experimento MEArray es preparar portaobjetos recubiertos con sustratos de impresión y para preparar la placa maestra de proteínas que se van a imprimir. A continuación, las matrices se imprimen con un robot de microarrays, las células se dejan adherir, crecer en cultivo, y luego se fija químicamente al alcanzar el punto final experimental. Ensayos fluorescentes o colorimétrico, con imágenes de microscopios tradicionales o escáneres de microarrays, se utilizan para revelar correspondientes fenotipos moleculares y celulares (Figura 1).
Protocol
Discussion
El método que aquí se presenta permite MEArray análisis funcionales de las células y las interacciones combinatorias microambiente 4. Análisis MEArray combina el uso de las tecnologías de micropatterning básicos, biología celular, y los robots de microarrays de impresión y dispositivos de análisis que están disponibles en muchas instalaciones multiusuario. MEArray pantallas son compatibles con la mayoría de tipos de células adherentes, aunque sin suero formulaciones de medios puede ser necesario …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML es compatible con el NIA (R00AG033176 y R01AG040081) y por el Laboratorio de Investigación Dirigida y Desarrollo, EE.UU. Departamento de Energía # contrato DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
Riferimenti
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
