Fremstilling og anvendelse af mikromiljø microarrays (MEArrays)
Summary
Et kombinatorisk funktionel screeningsmetode til at få indsigt i konsekvenserne af den molekylære sammensætning af mikromiljøer på cellulære funktioner er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af eksisterende mikroarray-baserede teknologier til at generere arrays af definerede kombinatoriske mikromiljøer, som understøtter celleadhæsion og funktionel analyse.
Abstract
Samspillet mellem celler og deres omgivende mikromiljø har funktionelle konsekvenser for cellulær adfærd. På enkelt celle niveau, kan forskellige mikromiljøer pålægge differentiering, migration og spredning fænotyper, og på vævsniveau mikromiljøet processer så kompleks som morfogenese og tumorigenese 1. Ikke alene cellulære og molekylære indhold af mikromiljøer virkninger cellerne inden, men det gør elasticiteten 2 og geometri 3 i vævet. Defineres som summen af celle-celle-,-ECM og-opløselige faktor interaktioner, ud over de fysiske egenskaber, er mikromiljøet kompleks. Fænotyperne af celler inden for et væv er delvis på grund af deres genomiske indhold og delvist på grund af de kombinatoriske interaktioner med microenviroment. En stor udfordring er at forbinde specifikke kombinationer af microenvironmental komponenter med karakteristiske adfærd.
ent "> Her præsenteres mikromiljøet microarray (MEArray) platform for cellebaseret funktionel screening af interaktioner med kombinatoriske mikromiljøer 4. Metoden giver mulighed for samtidig kontrol af den molekylære sammensætning og elasticitetsmodulet, og kombinerer brugen af almindeligt tilgængelig microarray og micropatterning teknologier. MEArray skærme kræver så få som 10.000 celler pr matrix, hvilket letter funktionelle studier af sjældne celletyper, såsom voksne stamceller. En begrænsning af teknologi er, at hele væv mikromiljøer kan ikke helt gentaget på MEArrays. En sammenligning af reaktioner i samme celletype til mange relaterede mikromiljøer, f.eks parvise kombinationer af ECM-proteiner, der karakteriserer et givet væv, vil tilvejebringe indsigt i, hvordan microenvironmental komponenter fremkalder vævsspecifikke funktionelle fænotyper.MEArrays kan udskrives ved hjælp af en lang række rekombinant GroGJ faktorer, cytokiner og oprenset ECM proteiner og kombinationer deraf. Platformen er kun begrænset af tilgængeligheden af specifikke reagenser. MEArrays er modtagelige for tidsforkortet analyse, men oftest anvendes til slutpunkt analyser af cellulære funktioner, der er målbare med fluorescerende prober. For eksempel er DNA-syntese, apoptose, erhvervelse af differentierede stater, eller produktion af specifikke genprodukter almindeligvis måles. Kort beskrevet er den grundlæggende strøm af en MEArray eksperiment er at fremstille objektglas overtrukket med trykning substrater og forberede masterplade af proteiner, der skal udskrives. Derefter arrays er trykt med en microarray robot, er cellerne lov til at fæstne, vokse i kultur, og derefter er kemisk fikseret efter at have nået den eksperimentelle endpoint. Fluorescerende eller kolorimetriske assays, afbildet med traditionelle mikroskoper eller microarray scannere, der anvendes til at afsløre de relevante molekylære og cellulære fænotyper (figur 1).
Protocol
Discussion
The MEArray metode præsenteres her muliggør funktionelle analyser af celle-og kombinatoriske mikromiljø interaktioner 4. MEArray analyse kombinerer brugen af basale micropatterning teknologier, cellebiologi og microarray trykning robotter og analyse enheder, der er tilgængelige i mange flerbruger faciliteter. MEArray skærme er kompatible med de fleste adhærente celletyper, men serumfrie medier formuleringer kan være nødvendigt at justere i nogle tilfælde at inkludere BSA eller <1% serum, hvi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ML støttes af NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og Laboratory Directed Forskning og Udvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
Riferimenti
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
