نموذج ثلاثي الأبعاد للخلية ثقافة قياس آثار تدفق السائل الخلالي على غزو الخلايا السرطانية
Summary
وارتقى الخلالي تدفق السوائل في الأورام الصلبة، ويمكن أن تعدل ورم غزو الخلية. نحن هنا وصفا لأسلوب لتطبيق الخلالي تدفق السوائل إلى الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة ومن ثم قياس آثارها على غزو الخلية. ويمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لدراسة النظم الأخرى.
Abstract
نمو وتطور الأورام الصلبة معظم تعتمد على التحول الأولي للخلايا السرطانية واستجابتها لسدى المرتبطة يشير في المكروية ورم 1. سابقا، وركز البحث على المكروية ورم في المقام الأول على الورم اللحمية التفاعلات 1-2. ومع ذلك، فإن المكروية ورم تتضمن أيضا مجموعة متنوعة من القوى الطبيعية الحيوية، وآثارها لا تزال غير مفهومة تماما. هذه القوى هي عواقب النشاط الحيوي لنمو الورم التي تؤدي إلى تغيرات في التعبير الجيني، وانقسام الخلايا، والتمايز وغزو 3. يتم تغيير جميع المصفوفة كثافة 4، صلابة 5-6، وهيكل 6-7، ضغط السائل الخلالي 8، وتدفق السوائل الخلالية 8 أثناء تقدم السرطان.
الخلالي تدفق السوائل على وجه الخصوص هو أعلى في الأورام بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية 8-10. ويقدر فلوريدا السائل الخلاليوتم قياس السرعات آه وجدت لتكون في حدود 0،1-3 ميكرومتر ق -1، اعتمادا على حجم الورم والتمايز 9 و 11. هذا يرجع إلى ارتفاع ضغط السائل الخلالي الناجم عن الورم الناجم عن الأوعية الدموية وزيادة نفاذية الأوعية الدموية 12. وقد تبين الخلالي تدفق السوائل لزيادة غزو الخلايا السرطانية 13-14، الليفية الوعائية وخلايا العضلات الملساء 15. هذا قد يكون عائدا لغزو التدرجات الكيميائي ذاتي خلقت حول الخلايا في D-3 16 أو زيادة مصفوفة الفلزي (MMP) التعبير 15، إفراز chemokine والتعبير جزيء التصاق الخلية 17. ومع ذلك، لم يتم الآلية التي تستشعر الخلايا تدفق السوائل مفهومة جيدا. بالإضافة إلى تغيير سلوك الخلية السرطانية، الخلالي تدفق السوائل ينظم نشاط الخلايا الأخرى في المكروية ورم. ويرتبط هذا مع التمايز القيادة (أ) من الخلايا الليفية إلى الأورام وmyofibrأقاليم 18، (ب) نقل من مولدات المضادات، وعوامل أخرى قابلة للذوبان إلى الغدد الليمفاوية 19، و (ج) تحوير التشكل الليمفاوية الخلية البطانية 20.
هذه التقنية المقدمة هنا يفرض الخلالي تدفق السوائل في الخلايا في المختبر، والكمي آثاره على غزو (الشكل 1). وقد تم نشر هذه الطريقة في دراسات متعددة لقياس الآثار المترتبة على تدفق السوائل في انسجة وخلية السرطان غزو 13-15، 17. من خلال تغيير التركيبة مصفوفة، نوع من الخلايا، وتركيز خلية، يمكن تطبيق هذه الطريقة على غيرها من الأمراض، ونظم الفسيولوجية لدراسة الآثار المترتبة على تدفق فراغي في العمليات الخلوية مثل غزو الانتشار، والتفريق، والتعبير الجيني.
Protocol
Discussion
هنا وقد وصفت لدينا منهجية لقياس تأثير تدفق الخلالي على غزو الخلايا السرطانية، وذلك باستخدام الخلايا جزءا لا يتجزأ من مصفوفة 3-D داخل خلية إدراج الثقافة. وقد استخدمت هذه الأساليب ومماثلة لدراسة تأثير تدفق الخلالي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا 13-15، 17. نهجنا ي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
Riferimenti
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimica. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
