תלת מימדי תרבית תאים מודל למדידת השפעת זרימת הנוזל ביניים על הפלישה תאים סרטניים
Summary
זרימת הנוזל ביניים הוא גבוה בגידולים מוצקים והוא יכול לווסת את הפלישה תאים סרטניים. כאן נתאר את הטכניקה ליישם זרימת הנוזל ביניים לתאים משוקע בתוך ולאחר מכן למדוד את השפעותיו על הפלישה התא. טכניקה זו ניתן להתאים בקלות ללמוד מערכות אחרות.
Abstract
צמיחה והתקדמות של גידולים מוצקים רוב תלויים השינוי הראשוני של תאים סרטניים ואת תגובתם stroma הקשורים איתות microenvironment הגידול 1. בעבר, מחקר על microenvironment הגידול התמקדו בעיקר גידולים סטרומה אינטראקציות 1-2. עם זאת, microenvironment הגידול כולל גם מגוון של כוחות Biophysical, אשר תופעות להישאר ממעטים להבין. כוחות אלה הם תוצאות ביומכניים של הגידול להוביל שינויים בביטוי גנים, חלוקת התא, התמיינות ופלישה 3. צפיפות מטריקס 4, נוקשות 5-6, והמבנה 6-7, לחץ נוזלים ביניים 8, ואת זרימת נוזל interstitial 8 משתנים במהלך כל התקדמות הסרטן.
זרימת הנוזל ביניים בפרט הוא גבוה יותר גידולים לעומת 8-10 רקמות נורמליות. נוזל מוערך ביניים FLמהירויות ow נמדדו ונמצא כי בטווח של 0.1-3 מיקרומטר s -1, תלוי בגודל הגידול והבחנה 9, 11. זאת בשל לחץ גבוה נוזל interstitial שנגרם על ידי הגידול אנגיוגנזה המושרית וחדירות כלי הדם מוגברת 12. זרימת הנוזל ביניים הוכח להגדיל את הפלישה של תאים סרטניים 13-14, fibroblasts כלי דם ותאי שריר חלק 15. פלישה זו עשויה לנבוע הדרגתיים chemotactic עצמיים שנוצרו סביב תאים 3-D 16 או עלה metalloproteinase מטריקס (MMP) הביטוי 15, הפרשת chemokine ו הידבקות התא מולקולות ביטוי 17. עם זאת, המנגנון שבאמצעותו התאים לחוש זרימת הנוזל אינה מובנת היטב. בנוסף שינוי התנהגות תאים סרטניים, זרימת נוזל interstitial מודולציה את הפעילות של תאים אחרים microenvironment הגידול. היא מזוהה עם בידול (א) נהיגה של fibroblasts לתוך הגידול, קידום myofibroblasts 18, (ב) ההובלה של אנטיגנים וגורמים מסיסים אחרים לבלוטות הלימפה 19, (ג) הלימפה ויסות תא האנדותל המורפוגנזה 20.
השיטה המוצגת כאן מטיל זרימת הנוזל ביניים על תאים במבחנה מכמת את השפעותיו על הפלישה (איור 1). שיטה זו פורסמו מחקרים רבים כדי למדוד את ההשפעות של זרימת הנוזל על סטרומה ופלישה סרטן תאים 13-15, 17. על ידי שינוי הרכב מטריקס, סוג התא, וריכוז התא, שיטה זו ניתן להחיל על מחלות אחרות ומערכות פיזיולוגיות כדי לחקור את ההשפעות של זרם ביניים על תהליכים תאיים כגון התפשטות הפלישה, בידול, ועל ביטוי גנים.
Protocol
Discussion
כאן אנו מתארים מתודולוגיה לכימות ההשפעה של זרימת ביניים על הפלישה תאים סרטניים, תוך שימוש בתאי משוקע בתוך 3-D בתוך להוסיף תרבית תאים. שיטות אלה דומים שימשו כדי ללמוד את ההשפעה של זרימת ביניים על מגוון רחב של סוגי תאים 13-15, 17. הגישה שלנו מחקה באופן חלקי microenvironment מטר…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Collagen (Rat Tail) | BD | 354236 | Keep sterile |
| Millicell cell culture insert | Millipore | PI8P01250 | 8 μm pore diameter, polycarbonate membrane |
| Matrigel | BD | 354234 | Keep sterile |
| PBS | Sigma Aldrich | 100M-8202 | 10x for preparing gel solution, 1x for washing steps |
| Sodium Hydroxide, 1.0N Solution | Sigma Aldrich | S2770 | Keep sterile |
| DMEM 1X | CellGro | 10-013-CV | Keep sterile |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | 511150 | Keep sterile |
| Penicillin Streptomycin | CellGro | 30002CI | Keep sterile |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-500 ml | 0.5% in PBS |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | 4% in PBS |
| Deionized Water | Keep sterile | ||
| 4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI) | MP Biomedicals | 0215757401 | 1 mg/ml stock solution |
| Mounting Solution | Thermo Scientific | TA-030-FM | |
| Trypsin-EDTA | CellGro | 25-052-CI | Keep sterile |
Riferimenti
- Cichon, M. A. Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).
- Proia, D. A., Kuperwasser, C. Stroma: tumor agonist or antagonist. Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).
- Dvorak, H. F. Tumor microenvironment and progression. J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).
- Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Engler, A. J. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Paszek, M. J. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Levental, K. R. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
- Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors. Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).
- Dafni, H. Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin. Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).
- Chary, S. R., Jain, R. K. Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).
- Heldin, C. H. High interstitial fluid pressure – an obstacle in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).
- Fukumura, D. Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models. Microcirculation. 17, 206-225 (2010).
- Shields, J. D. Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling. Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).
- Shieh, A. C. Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts. Cancer Res. 71, 790-800 (2011).
- Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen. PLoS One. 6, e15956 (2011).
- Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions. Biophys J. 91, 113-121 (2006).
- Miteva, D. O. Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium. Circ. Res. 106, 920-931 (2010).
- Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro. J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).
- Kunder, C. A. Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes. J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).
- Helm, C. L. Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).
- McGuire, P. G., Seeds, N. W. The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells. J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).
- Kleinman, H. K. Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma. Biochimica. 21, 6188-6193 (1982).
- Haessler, U. Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber. Integr. Biol. (Camb). , (2011).
- Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).
