Um modelo tridimensional de Cultura Celular para avaliar os efeitos de fluxo de fluido intersticial na invasão da célula tumoral

Summary

Fluxo de fluido intersticial é elevada em tumores sólidos e pode modular a invasão de células tumorais. Descrevemos aqui uma técnica para aplicar o fluxo de fluido intersticial para as células embebidas numa matriz e, em seguida medir os seus efeitos sobre a invasão celular. Esta técnica pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas.

Abstract

O crescimento ea progressão da maioria dos tumores sólidos dependem da transformação inicial das células cancerosas e da sua resposta ao estroma associado à sinalização no microambiente do tumor ^1. Anteriormente, a investigação sobre o microambiente do tumor tem se concentrado principalmente em tumores estromais interações ^1-2. No entanto, o microambiente do tumor também inclui uma variedade de forças biofísicas, cujos efeitos permanecem pouco compreendidas. Estas forças são conseqüências biomecânicas do crescimento do tumor que levam a mudanças na expressão gênica, a divisão celular, diferenciação e invasão ^3. Matriz de densidade ^4, rigidez ^{5-6, 6-7} e estrutura, a pressão do fluido intersticial ^8, e fluxo de fluido intersticial ⁸ são todos alterada durante a progressão do cancro.

Fluxo de fluido intersticial em particular, é maior em tumores em comparação com ^8-10 normais tecidos. O fl fluido intersticial estimadoow velocidades foram medidos e verificou-se ser na gama de 0,1-3 uM s ^-1, dependendo do tamanho do tumor e diferenciação ^{9, 11.} Isto é devido à pressão do fluido intersticial elevada causada por induzida por tumor angiogénese e aumento da permeabilidade vascular ^12. Fluxo de fluido intersticial foi mostrado para aumentar a invasão de células de cancro ^13-14, fibroblastos vasculares e células de músculo liso ^15. Esta invasão pode ser devido aos gradientes de quimiotáticas autólogas criados em torno de células em 3-D ¹⁶ ou aumentada metaloproteinase de matriz (MMP) expressão ^15, a secreção de quimiocinas e células expressão da molécula de adesão ^17. No entanto, o mecanismo pelo qual as células sentir o fluxo de fluido não é bem compreendida. Além de alterar o comportamento das células do tumor, o fluxo de fluido intersticial modula a actividade de outras células no microambiente do tumor. Ele está associado (a) diferenciação de condução de fibroblastos em tumor-promoção myofibroblasts ^18, (b) transporte de antigénios e outros factores solúveis para linfonodos ^19, e (c) modulando linfático morfogénese de células endoteliais ^20.

A técnica aqui apresentada impõe fluxo de fluido intersticial em células in vitro e quantifica os seus efeitos sobre invasão (Figura 1). Este método tem sido publicado em vários estudos para medir os efeitos de fluxo de fluido sobre estroma e invasão de células do cancro ^{13-15, 17.} Ao alterar a composição da matriz, tipo de célula, e concentração de células, este método pode ser aplicado a outras doenças e sistemas fisiológicos para estudar os efeitos de fluxo intersticial em processos celulares, tais como invasão, diferenciação, proliferação e expressão de genes.

Protocol

1. Ensaio Set-up Descongelar uma pequena alíquota (<uL 500) de Matrigel em gelo a 4 ° C (cerca de 2 h). Preparar receita gel (ver volumes exemplo na Tabela em baixo): PBS 10x (1x em volume total), hidróxido de sódio 1N (equivalente a 0,023 volumes de colagénio adicionado, ou segundo as recomendações do fabricante de colagénio, como apropriado), Matrigel e colagénio do tipo I para concentrações finais de 1 mg / ml e 1,3 mg / ml, respectivamente (formulações de matriz podem ser utiliza…

Discussion

Aqui temos descrito um método para quantificar o efeito do fluxo intersticial na invasão de células de tumor, utilizando células embebidas numa matriz de 3-D dentro de uma inserção de cultura de célula. Isto e métodos semelhantes têm sido utilizados para estudar o efeito de fluxo intersticial em uma variedade de tipos de células ^{13-15, 17.} A nossa abordagem parcialmente imita o microambiente matriz do tumor usando colagénio tipo I e Matrigel que contêm proteínas encontradas na membrana basal de t…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Collagen (Rat Tail)	BD	354236	Keep sterile
Millicell cell culture insert	Millipore	PI8P01250	8 μm pore diameter, polycarbonate membrane
Matrigel	BD	354234	Keep sterile
PBS	Sigma Aldrich	100M-8202	10x for preparing gel solution, 1x for washing steps
Sodium Hydroxide, 1.0N Solution	Sigma Aldrich	S2770	Keep sterile
DMEM 1X	CellGro	10-013-CV	Keep sterile
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	511150	Keep sterile
Penicillin Streptomycin	CellGro	30002CI	Keep sterile
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500 ml	0.5% in PBS
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500	4% in PBS
Deionized Water			Keep sterile
4′,6-diaminido-2-phenylindole (DAPI)	MP Biomedicals	0215757401	1 mg/ml stock solution
Mounting Solution	Thermo Scientific	TA-030-FM
Trypsin-EDTA	CellGro	25-052-CI	Keep sterile