Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

Summary

La dopamina è distintamente regolata nel mesencefalo nuclei, che contengono la cella corpi e dendriti dei neuroni dopaminergici. Qui si descrive un approccio di dissezione e di manipolazione dei campioni per massimizzare i risultati e, quindi, le conclusioni e le intuizioni, sulla regolamentazione dopamina nel mesencefalo nuclei della substantia nigra (SN) e la zona ventrale tegmentale (VTA) in roditori.

Abstract

Dopamina è un neurotrasmettitore vigorosamente studiato nel SNC. Infatti, il suo coinvolgimento in attività locomotoria e la ricompensa comportamento correlato ha favorito cinque decenni di inchiesta sulle carenze molecolari associati con regolazione della dopamina. La maggior parte di queste indagini di regolazione della dopamina nel cervello, la messa a fuoco sulla base molecolare per la sua regolamentazione nel campo delle regioni terminali dei percorsi nigrostriatali e mesoaccumbens, striato e nel nucleo accumbens. Inoltre, tali studi si sono concentrati sull'analisi del tenore di tessuto dopamina con normalizzazione a un solo peso del tessuto bagnato. Indagine delle proteine ​​che regolano la dopamina, come la tirosina idrossilasi (TH) di proteine, fosforilazione TH, trasportatore della dopamina (DAT), e vescicolari trasportatore monoamine 2 (VMAT2) proteina spesso non includono l'analisi del tenore di tessuto dopamina nello stesso campione. La capacità di analizzare sia il contenuto della dopamina dei tessuti e delle sue proteine ​​di regolazione (compresa la post-tramodifiche nslational) non solo dà potere intrinseco di interpretare il rapporto della dopamina con il livello di proteine ​​e la funzione dei TH, DAT, o VMAT2, ma si estende anche all'economia del campione. Ciò si traduce in un costo minore, e tuttavia produce approfondimenti nel regolamento molecolare di dopamina in qualsiasi paradigma di scelta degli investigatori.

Ci concentriamo le analisi nel mesencefalo. Anche se il SN e VTA sono in genere trascurati nella maggior parte degli studi di regolazione della dopamina, questi nuclei sono facilmente sezionato con la pratica. Una lettura completa di tenore di tessuto dopamina e TH, DAT, o VMAT2 può essere condotto. Vi è fiorente letteratura sull'impatto della funzione della dopamina nel SN e VTA sul comportamento, e le impingements di sostanze esogene o di processi di malattia ivi ^1-5. Inoltre, i composti come fattori di crescita hanno un effetto profondo sulla proteine ​​dopamina e dopamina-regolazione, in misura relativamente maggiore nella SN o VTA <sup> 6-8. Pertanto, questo metodo viene presentato come riferimento per i laboratori che vogliono estendere le loro indagini su come trattamenti specifici modulano il comportamento e la regolazione della dopamina. Qui, un multi-step metodo viene presentato per le analisi del tenore di tessuto dopamina, i livelli proteici di TH, DAT o VMAT2 e fosforilazione TH dalla substantia nigra e VTA dal mesencefalo roditori. L'analisi della fosforilazione TH può dare spunti significativi in ​​non solo come l'attività TH è regolata, ma anche le cascate di segnalazione colpiti nei nuclei somatodendritic in un paradigma dato.

Si illustrerà la tecnica di dissezione per separare questi due nuclei e il trattamento del campione di tessuto sezionato che produce un profilo rivelando meccanismi molecolari di regolazione dopamina in vivo, specifici per ogni nuclei (Figura 1).

Protocol

1. Dissezione Su un letto di wet-ghiaccio, raffreddare una matrice cervello dei roditori (sezioni coronali segregato 1 millimetro di distanza), una capsula di Petri contenente 5 rasoi, e un bisturi # 11. In un contenitore separato, posto etichettato tubi microcentrifuga da 2 ml di grandezza in ghiaccio secco. Il ricercatore scegliere il metodo di eutanasia. Abbiamo risultati riproducibili effettuazione di una anestesia molto breve con isoflurano, idealmente, un vaporizzatore deve essere usato. Tutta…

Discussion

Come illustrato nella figura 1, i metodi descritti sopra dovrebbe produrre letture multiple di dopamina e della sua TH proteine ​​che regolano, DAT, e VMAT2 da un campione di SN o VTA ottenuti dal ratto o topo. Anche in questo caso, i benefici di realizzare questo protocollo è che il ricercatore può ottenere letture operativamente trovati di come dopamina è regolata in vivo in virtualmente qualsiasi paradigma sperimentale e, così facendo, risparmiare notevoli risorse sperimentali riducendo il numero di …

Materials

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45°C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	– J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo- Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.

Reagents	Formulas
10% SDS	10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)	10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution	1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer	Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer	Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)	Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)	Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau	Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution	5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)	PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)	Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock ¹¹.