En metod för storskalig rening av APP intracellulär domän (AICD) beskrives. Vi beskriver också metoder för att inducera<em> In vitro</em> AICD aggregering och visualisering av atomkraftsmikroskopi. De beskrivna metoderna är användbara för biokemisk / strukturell karakterisering av AICD och effekterna av molekylära chaperoner på dess aggregering.
Amyloid prekursorprotein (APP) är en typ I transmembranprotein i samband med patogenesen av Alzheimers sjukdom (AD). APP kännetecknas av en stor extracellulär domän och en kort cytosolisk domän kallas APP intracellulär domän (AICD). Under mognad genom den sekretoriska vägen, kan APP klyvas av proteaser kallade α, β, och γ-secretases 1. Sekventiell proteolytisk klyvning av APP med β och γ-secretases leder till produktion av en liten proteolytisk peptid, benämnd Ap, som är amyloidogena och kärnan beståndsdelen i senila plack. Den AICD är också befriad från membranet efter sekretas bearbetning och genom interaktioner med Fe65 och Tip60 kan translokeras till kärnan för att delta i transkriptionsreglering av flera målgener 2,3. Protein-protein interaktioner som involverar AICD kan påverka handeln, bearbetning och cellulära funktioner holo-APP och dess C-terminal-fragment. Vi har nyligen visat att AICD kan aggregat in vitro, och denna process hämmas av AD-inblandad molekylär kaperon ubiquilin-1 4. I överensstämmelse med dessa resultat har AICD utsatt hydrofoba domäner och är i sig störda in vitro 5,6, men den får stabil sekundär struktur vid bindning till Fe65 7. Vi har föreslagit att ubiquilin-1 förhindrar olämpliga inter-och intramolekylära interaktioner av AICD, förhindra aggregation in vitro och i intakta celler 4. Medan de flesta studier fokuserar på betydelsen av APP i patogenesen av AD, är den roll som AICD i denna process inte klart. Expression av AICD har visats inducera apoptos 8, att modulera signalvägar 9, och för att reglera kalcium signalering 10. Överuttryck av AICD och Fe65 i en transgen musmodell inducerar Alzheimers som patologi 11, och nyligen AICD har upptäckts i behåi lysat genom Western blotting vid användning lämpliga tekniker antigenåtervinning 12. För att underlätta strukturella, biokemiska och biofysiska studier av AICD, har vi utvecklat ett förfarande för att framställa rekombinant stora mängder mycket ren AICD protein. Vi beskriver vidare ett förfarande för att inducera in vitro termiska aggregering av AICD och analys med atomkraftsmikroskopi. De beskrivna metoderna är användbara för biokemisk, biofysik, och strukturella karakterisering av AICD och effekterna av molekylära chaperoner på AICD aggregering.
I detta protokoll vi har beskrivit ett förfarande för att erhålla högren AICD för strukturella, biofysiska och biokemiska analyser. Detta förfarande kräver inte sofistikerade kromatografi utrustning och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier. Andra grupper har renat AICD 5-7,16, inklusive GST-AICD 17-19, för biokemiska / strukturella analyser. Nackdelar med föregående protokollen är dålig löslighet AICD 16, mindre än idealisk renhet 17, och kravet …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) för APP cDNA. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Kapitalförsäkringar fonden för biomedicinsk forskning (AFO) samt Jean C. och William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB är en lärd i translationell forskning Scholar Program och medlem av University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper äldre amerikaner Independence Center (med stöd av NIH bidrag UL1RR029876 och P30-AG-024.832, respektive).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |