Summary
一种成像技术用于监测具有亚微米的空间和亚毫秒时间分辨率的膜电位的变化进行说明。技术，基于电压敏感染料激光激发，使测量信号的轴突和轴突抵押品，终端树突分支，和个人的树突棘。
Abstract
了解单个神经元的生物物理特性和功能组织，以及他们是如何处理信息的理解大脑是如何工作的根本。任何神经细胞的主要功能是处理电信号，通常是从多个源。电性能的神经元的过程是极其复杂的，动态的，并且，在一般情况下，不可能预测在没有详细的测量。为了得到这样的测量1，理想的情况下，能够监控，在多个地点，亚阈值事件，因为它们从原产地的网站上神经元的过程和summate在特定的位置，影响动作电位开始。在任何神经元由于采用电极测量技术的限制，这一目标一直没有实现。为了克服这个缺点，它是非常可取的成像技术，允许广泛的平行recordin补充补丁电极的方法GS来自全国各地的神经元。在这里，我们描述了这样的技术-光记录的有机电压敏感染料（Ⅴ 米成像） -其特征在于由亚毫秒和亚微米分辨率的膜电位的瞬态。我们的方法是基于对电压敏感的分子探针2的开拓性工作。的初始技术的许多方面已不断提高超过几十年3，5，11。此外，以前的工作记录的V 米成像的两个基本特征。首先，荧光信号是线性正比于在整个生理范围（-100 mV到+100 mV，10，14，16）的膜电位。其次，装载与这里所使用的电压敏感染料（JPW 3028）神经元没有检测到的药理作用。记录扩大在穗染料吸附量是完全可逆的，7。此外，实验证据表明，它是能够得到一个显著的数量多达数百录音之前，任何检测到的光毒性作用4，6，12，13。目前，我们利用的高超近最佳波长的灵敏度最大化的V 米成像技术的激光光源的亮度和稳定。目前的灵敏度，允许多个站点的光学录音的V M瞬变的一个神经元的所有部分，包括轴突和轴突抵押品，终端树突分支，以及个人的树突棘。所获取的信息的信号相互作用的可定量分析以及直接可视化在一部电影的形式。
Protocol
1。设备安装
步骤1.1。影像设定
记录电压敏感染料信号的关键是适当的安装设计。我们使用配备三个摄像头的直立显微镜（BX51WI奥林巴斯或蔡司AxioExaminer的）。是专为照明单个神经元在大脑切片在落射荧光，激发光的宽视场显微镜模式，可以使用尼康60X/1.0 NA NA或蔡司63X/1.0的水浸渍目标的设置。我们的显微镜是用螺栓固定到一个隔振表，并配备与机动项目可动阶段。每个显微镜配备了3个摄像头端口。 One相机端口有一个标准的高空间分辨率的CCD摄像头，用于红外DIC的视频显微镜（IR-1000，美国），打格MTI。第二个摄像头端口有一个快速的摄像头数据采集（高达20 kHz的帧速率）与相对较低的空间分辨率（80×80像素），但具有出色的动态范围（14位）和极低的读噪声（NeuroCCD-SM，RedShirtImaging有限责任公司，迪凯特，GA）。第三相机端口具有高空间分辨率的CCD照相机（PixelFly，1392x1024像素; PCO AG，德国）上安装的纺丝盘的共焦扫描仪（CSU-10，日本横河，）用于收集的共焦图象的z栈详细的形态学重建染的细胞。一个倍频二极管泵浦Nd：YVO4连续波激光（400 mW）的发射在532 nm电厂（MLL-III/400兆瓦; CNI，长春，中国）是的源激发光。的2毫米直径的由快门（LS6;文森Associates）的选通的激光束被引导到导光耦合到一个单端口设计背面孔径装得过满的落射荧光冷凝器（TILL Photonics公司，Gräfelfing，德国）通过显微镜目标和提供接近的物体面的均匀的照明。激光被用于代替常规的氙弧灯的V 间成像的灵敏度最大化：（1）使用一个单色的前引用光的吸收光谱的红翼V M灵敏度的染料9，10和（2）增加的激发光的强度以外的水平，可以通过以下来实现的电弧灯最大化。由与中心波长为560nm和记录的荧光通过610nm的屏障过滤器（肖特RG610）通过的分色镜的激发光被反射到该制剂。光强度的增加和使用接近最佳的单色激发波长的综合效果，在电压成像的灵敏度相比，以前的测量6 -约50的一个因素是一个显着的改善。
步骤1.2。调整为均匀的照明
使用的荧光滑标准（绿色激发/红色发射）。插入适当的中性密度过滤器，以便在激光束光路的不饱和的CCD。聚焦目标的表面上在幻灯片上。调整石英导光体，在前面的激光发射器的目标位置的接收端，和调整的输出端连接到显微镜使用适当的致动器上的落射荧光冷凝器来实现的导光的位置为中心的和均匀的视场照明。
步骤1.3。确定振动噪声
将一个小的黑色墨水标记的表面上的荧光幻灯片。记录光强度与NeuroCCD在连续记录模式。在黑暗边缘的黑色墨迹，聚焦目标。记录光的强度在2 kHz的帧速率约100毫秒。显示分数的光强度的痕迹（ΔF/ F）从接收的光均匀地照射的区域，从〜20沿墨水标记的边缘的像素〜20像素的空间平均值。在录音像素高对比度的边缘多余的噪音反映了振动噪声系统。
步骤1.4。隔振
它是强制性的，通过使用振动隔离表媲美实验记录条件的光强度的散粒噪声的电平以下时，以减少振动。调整的振动隔离表，直到从覆盖的图像的锐利的边缘的像素的光强度的振动噪声可以忽略不计的。没有运动部件（机械快门，风扇）的设备可被安装在桌子上。从设备连接到其他组件不振动隔离在桌子上的电缆必须是宽松的，使他们不传输机械振动的显微镜。
2。选择一个适当的神经元为V 米影像
步骤2.1。神经元的选择
根据标准程序，使脑切片。使用鼠标线，我的神经细胞表达EGFPnterest。一个旋转盘共聚焦系统，可视化EGFP标记的切片中的神经元。选择为V 米成像神经元与完整的树突状/轴索树木，并与正在运行的进程的切片的表面平行且靠近。这不能被实现，在野生型小鼠，因为轴突和薄的枝晶，在大多数情况下，是不可见的在DIC的显微镜模式。
3。将神经元与电压敏感染料
步骤3.1。填写的补丁吸管
填充的前端与无染料的细胞内溶液的玻璃的补丁移液器从通过施加负压力约15秒的电极锥度的三分之二。在管尖中的染料的免费的解决方案是必要的，以防止泄漏的染料到增加的背景荧光，并极大地减少了信号噪声比的切片。返回填充含有的膜不能渗透电压敏感染料JPW3028溶解的溶液与所述电极在细胞内的溶液（0.8毫摩尔）。
JPW3028，最成功的电压探头的细胞内的应用程序，是双带正电的类似物ANEP一系列的亲脂性的苯乙烯基染料，仍然是足够的水溶性要用于显微注射。二-乙基类似物，该染料具有几乎相同的特性（包括电压灵敏度）和市售JPW1114（ 见表1）。我们准备20毫米原液在蒸馏水中H 2 O。 50μl的等分试样的原液冷冻保存于-20℃下对于最终的染料浓度为0.8 mM的，2微升原液溶解在50μl的细胞内溶液在实验当天。的库存中的染料溶液是稳定的，可以在室温下保持数个月。因此，我们在室温下保持50微升等分，直到它被用完。
步骤3.2。迅速建立一个千兆密封
步骤3.3。监视水平的染色
在整个细胞结构的染料扩散的过程中，在电流钳模式下记录诱发电位监测的神经元的生理状态。此外，监测通过记录的2 k的帧速率从胞体的静息的光强度（RLI）染色的量 Hz和在全光强度调节中性密度过滤器（从400 mW的激光，我们使用的激光的光强度的0.04％）的一小部分。继续染料的加载过程，直到行动的潜力开始扩大，通常在20-40分钟，取决于电极的大小和阻力。
尖峰的扩大是完全可逆的，最有可能是由于容性负载体膜中的染料的饱和浓度的影响。尖峰的波形的完全恢复后的染料浓度为整个神经元平衡。
步骤3.4。删除的染料电极
在染色期间结束，修补程序移液管小心地拉出距离苏摩在确保从全细胞过渡外满分补丁配置的过程中达到的电压钳位配置。
步骤3.5。等待染料扩散
耳鼻喉科“>的一个额外的1.5-2小时，在室温下孵育切片，以允许的电压敏感染料扩散到神经元的过程。后显着量的染料扩散远离苏摩成树突和轴突的过程，的波形的AP完全恢复。4。光学记录
步骤4.1。选择一个与细胞成像
找到染色的神经元胞体在低光照水平荧光和重新修补贴片电极下DIC的标准（染料）的神经元。可视化神经元的过程，低光照下在10-40赫兹电压成像在CCD的连续记录模式中的帧速率的水平。减少光的中性密度滤镜感兴趣的对象，可视化所需的最低水平。染色的神经元的定位过程中，我们使用0.01％的400 mW的激光强度。使用XY阶段，定位在t神经元过程中的利益他中的摄像区域。保护苏摩从激励光用的局部封闭的显微镜的视场光阑光圈。屏蔽胞体由高强度激发光在录制过程中会显着减少光动力损伤。
步骤4.2记录膜电位瞬态相关的光信号
记录光信号backpropagated个人树突分支的AP。记录光信号，在轴突向受影响。光学记录到在树突棘backpropagating接入点的信号。使用适当的准确重建信号波形的帧速率，并保持尽可能短的记录期间，暴露于高强度的激励光，以尽量减少染料漂白和光动力损伤。例如，检查序列的萌生和扩展的单个动作电位在轴突需要记录周期为5-10毫秒。激发光强度在记录过程中的性是一方面上的信号 - 噪声比，和染料的褪色程度和另一方面的光动力损伤之间的一种折衷。我们使用100％的强度为400 mW的激光在录音时的照明面积的直径为300微米的神经轴突的长款。当激发光被聚焦到一个的树突棘成像30微米直径的区域，我们使用的激光的光强度的10-25％。所需的时间记录的最佳激发光强度是一个重要的决定因素;较短的记录时间允许更高的光强度。最好凭经验确定最佳的光照强度为每个制备和测量设置。
5。数据分析
步骤5.1。已知的错误，更正原始数据
使用NeuroPlex的程序（RedShirtImaging）编写的IDL（ITT视觉信息Solut进行分析和显示数据离子，博尔德，科罗拉多州）和自定义Visual Basic例程。低光水平的条件下，背景荧光的ΔF/ F信号的大小成为一个显着的行列式。此效果，首先被纠正的原始数据减去从一个未染色的区域中的片上确定的平均背景荧光强度。随后，信号校准软件，用于纠正在AP启动的时间抖动以及可能的小运动的准备期间平均。在时域，AP信号对齐的电记录的AP在每个试验，以在开始的平均获取的参考信号（ 图1B）通过交叉相关。在空间域中，图像对准在两个维度脱机的图像交叉相关的，以补偿可能的小的横向运动的准备。正确的聚焦在z维度上的图像之前，验证每个单独的试验; SMaL公司升调整往往是必要的。空间和时间上对齐的信号的平均值，如在图1B中所示。由于染料漂白，缓慢变化的光强度除以来自试验用无刺激（ 图1B）的记录由一个适当的双指数函数的数据进行校正。从一组数据点，用三次样条插值，分段连续曲线通过每个数据点的AP信号的波形重建。从胞体中，电的AP信号进行比较，以确认电压敏感染料信号跟踪膜电位没有显着的失真在毫秒时间尺度的光的AP信号为如图3B中所示，从相邻的轴突的小丘。这两个信号叠加关系十分密切，使散粒噪声光学记录。
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图1。数据分析（动画）。 （A）上图：高分辨率的共聚焦图像的彩色神经元轴突在记录位置。记录电极附着胞体和细胞外刺激电极基枝晶示意性地示出。外，突触刺激诱发的动作电位。下图：低空间分辨率的荧光图像的轴突用于V M成像。通过CCD（B）的电极记录从SOMA（黑色痕迹），光学录音AIS（红色痕迹），并从郎飞结点的（绿色的痕迹） 。顶部的痕迹：原始数据来自9个试验，在AP启动的时间抖动。第二排的痕迹：时间对准信号。第三排：平均信号的痕迹。第四排的痕迹：漂白校正。底部的痕迹：三次样条插值的时间平滑的一次。
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Representative Results
激光共聚焦显微镜成功应该能够清楚识别的完整的神经元突起的切片的表面，这是在一个平面上的重点。这是适当的电压成像之前的电压敏感染料荷载的神经细胞的选择是至关重要的。皮质切片表达EGFP（Crym转基因小鼠品系）的L5锥体神经元的共焦图象的一个例子是在图2中所示。单个神经元的轴突都清晰可见。细胞在一个平面上的焦点的切片的表面接近与的长期完好轴突（白箭头）被选定。
图2。L5 V M-AP信号成像的皮层神经元轴突的选择。低（左）和高（右）放大图像在同一个片地区; 488 nm激发横河旋转的光盘扫描仪。
钠通道集群中的轴突起始段（AIS）的空间分布格局的调整已被证明调解新形式的神经元的可塑性，在轴突的神经元计算，钠通道分布的变化起着至关重要的作用。然而，免疫组化分销渠道的数据可能无法直接预测时空特性的动作电位开始，和前电的措施是间接的（外），或缺乏足够的空间分辨率（内）直接刻画尖峰触发区（TZ）。在膜电位成像技术，这里所描述的灵敏度提高的一个重要的方法可以直接测定的位置和长度定义在功能方面的秒杀TZ。记录在高空间和时间分辨率的AP信号的一个例子的图3中所示， 图3B示出该的V 间成像的时间是可用的灵敏度足够的亚阈值的去极化前再生的AP信号的准确的监测。此外，从体躯/轴突小丘和从更远侧节点朗维埃光学AP信号的比较证实，接入点有显着不同的动态在这两个位置8，15;的AP上行程和向下快节点朗维埃。有关的秒杀TZ的大小和位置的测量中的时空分辨率的限制的详细信息，请参阅图3和图5 Popovic 等人 （2011年）。
图3。从轴突的动作电位信号。 （A）上图：高分辨率的共聚焦图像的L5皮层神经元轴突在记录位置的电压敏感染料的加载，投影FROM一个Z-Stack的共聚焦图像。记录/刺激贴片电极连接到SOMA。下面板：由CCD获得的轴突为V 米成像使用的低空间分辨率的荧光图像。 （B）的AP相关的信号记录为10 kHz的帧速率。右边：AP瞬变从三个位置：1电极记录从体躯; 2 - 光记录轴突小丘; 3 - 光记录从第一个节点的朗维埃轨迹。的底部的痕迹：叠加信号从相同的三个位置。
还没有完全理解的兴奋性突触后电位（EPSPs）和BAPS负责诱导LTP树突之间的非线性相互作用。这种相互作用严格依赖于两个信号的振幅，因此，必须是空间非均匀。这一预测的实验测试需要空间以及分辨测量尚未进行，因为小直径的树突分支不是电极测量ccessible到。膜电位的成像技术，这里描述的允许电信令监测，如在图4中示出从多个位置在整个树突状乔木。树突状乔木，苯并（a）芘活动的模式的特点是中钠电流占主导地位的尖峰近端地区为主逐渐转变为长期的钙电流去极化远端树突的事件。
图4从刀杆的L5的皮质神经元树突的多个位置上的动作电位的信号。左图：加载的电压敏感染料的L5皮层神经元的高分辨率图像，从Z-Stack的共聚焦图像的投影。右面板：在100 Hz的短去极化电流脉冲传递到胞体（下部曲线）的4 AP发起了一阵。 Backpropagating一个ction 6个选定的位置（1-6）沿顶和斜枝晶的潜在信号。从一个单一的审讯记录，跟踪1至3。轨迹图4是四个试验的平均值，而迹线5和6是16个试验的平均值。
刺的假设，即有电的作用，改变突触效能的基础可塑性和可能的学习和记忆的机制最近获得了相当多的关注，因为其重要的意义脑功能（Yuste，2010）。有，然而，很少直接的实验证据支持或反对这个假说。在解释的间接结果的不确定性和缺乏直接证据树突棘的电气性能，主要是由于方法论的限制 - 树突棘是小的，而不是传统的电生理方法。因此，试图探讨这个问题依赖于实验数据的情况下，根据脊柱颈部的脊柱形态和扩散特性的计算机模拟与电气参数的估计。电压成像在这里描述的方法，使得它可以监视动作电位信号的高灵敏度的空间尺度与个人的树突棘和突触电位信号。实验现在可以直接测试的基本理论预测的树突棘的电气性能。在图5中示出的光信号的一个例子涉及到在一个单独的树突状脊椎和其父枝晶的AP backpropagating。
图5。动作电位信号从一个单独的树突棘。左面板：上部显微照片 - 解剖重建得到的从旋转磁盘的共焦图象的堆栈。下显微照片 - 佛罗里达州uorescence为V 米成像与CCD摄像机获得的图像的同一区域。右面板：从1-3概述了CCD图像的位置，相应的苯并（a）芘荧光强度的痕迹。时间平均9个试验。底部的轨迹：从胞体的电极记录。请注意，跟踪从一个地区无脊椎有没有可察觉的信号，表明水平低，光散射片在表面层的。
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Discussion
本文介绍了一种电压敏感染料的记录方法监测与亚微米和亚毫秒级的时空分辨率的单个神经元的电活动。激光激发在接近最优波长（关于信号的大小）提高了灵敏度的记录〜50比以前的方法的一个因素。目前的灵敏度，使电信号监测单个神经元的所有部分，包括树突，轴突，轴突抵押品和轴突终端以及个人的树突棘。目前的灵敏度，可以进行录音膜电位瞬态高达20 kHz的帧速率。适度的信号平均（4-25试验），可以很容易地提高记录的灵敏度的信号 - 噪声比表示为2-5的一个因素。电压成像的主要限制是缺乏的绝对电压规模的多个位置上的光信号从简单的校准。在一些准备工作S此发现在所有的地方，有一个已知幅度的膜电位信号，就可以解决。 AP信号的轴突和一些完全兴奋的树突6提供了一个极好的校准标准。
这种方法的应用中的关键步骤是：
- 限制的录音急性脑切片（<30微米）表面附近的神经元位于光散射的影响降至最低。这需要优化在切片过程中，以获得高的百分比，在上层中的片1的健康的神经元。
- 透明的溶液的量的优化，在电极提供的染料，以保证快速加载的神经元的前端。
- 消除机械振动的制备，它可以是一个光记录中的过量噪声源。
- 采用低噪声的连续波（CW）激光器与RMS噪声振幅<0.5％作为源的前引用光。
- 通过选择适当的激发光的强度相对于记录期间的持续时间，并通过分离由黑暗期间连续录音控制光动力损伤。更长的记录时间要求较低的光照强度，以防止光动力损伤。
上述例子所示的记录表明脊椎和轴突生理的一个转折点。这些录音揭示了显着的力量，能够直接记录电活动只能进行分析，在过去的理论依据。
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Disclosures
德扬Zecevic宣称他是共同拥有的RedShirtImaging有限责任公司，该公司专注于高转速，低噪音CCD相机采用电压敏感染料记录。所有其他的作者报告说目前的研究没有经济利益或潜在的利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢我们的的合作者克努特Holthoff，亚瑟Konnerth和Marco Canepari参加这种技术处于最初的发展以及对Leslie M.勒夫好心提供染料。由国家科学基金会资助IOS-0817969，国立卫生研究院资助NS068407和M136043和在耶鲁大学Kavli研究所神经科学支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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