1. 사전 실험 준비 여섯 솔루션을 (작품에 대한 표 1 참조) 준비 : () 100 ML NZR (정상 zebrafish 벨소리의), (B) 50 ML NZR + Tricaine (MS222), (C) 10 ML NZR + BSA, (D) 100 ML의 LoCaS (저 칼슘 2 + 솔루션), (E) 10 ML LoCaS + papain, (F) 100 ML K + – 내부 솔루션입니다. 솔루션 (가), (B), (D)와 (F) 4 ° C.에서 최대 1 개월에 저장할 수 있습니다 솔루션 (C)하며 (e)에서 실험의 날을 준비해야합니다. 모든 솔루션은 실험을 시작하기 전에 실온에서해야합니다. 라벨 약 중간 솔루션 (A), (C), (D)로하고 (E) 4 35mm 페트리 요리를 채 웁니다. Sylgard (다우 코닝, 미들랜드, MI)와 60mm 페트리 접시를 입력 한 다음 생선이 끝난 팁 않고 똑바로 앉을 수 그것을에 구멍을 절단하여 해부 접시를합니다. 유리의 끝 부분에 개 머리 접착 고치 끝에서 두 개 이상의 셀 절연 도구를 준비superglue과 파스퇴르 피펫은 머리가 약 0.5 cm하여 피펫의 끝을 지났 확장 할 수 있도록합니다. 래브라도 리트리버의와 Weimaraners 같은 부드러운 부드러운 털로 덮인 개에서 머리카락이 잘 작동합니다. 2. 청각 및 Vestibular 미궁의 절연 NZR + Tricaine를 포함하는 비커에 빠져있는 성인 zebrafish를 희생. 모든 opercular 움직임이 정지 할 때까지 시각적으로 아가미를 모니터링 할 수 있습니다. 물고기를 제거하고 신선한 NZR와 린스하기 전에 추가로 10 분 동안 기다리십시오. 이러한 절차는 기관 동물 케어의 승인을 페퍼 다인 대학위원회 (IACUC)를 사용하지만, 승인을 자신의 기관에서 취득해야했습니다. 에 물고기를 핀 머리에서 거리의 절반에 하나의 3 분 등쪽 – 복부 축으로 각 눈 소켓 세 번째 핀을 통해 하나의 표준 재봉 스트레이트 핀 (약 2.5 cm 길이)를 삽입하여 요리 등의 측면을 해부 에 도시 된 바와 같이 꼬리에그림 1A. 줌 (0.62-5 배) 10 배 접안 렌즈가 장착 스테레오 해부 현미경에서 약 점에서 두개골 지붕을 제거하여 뇌와 척수의 짧은 세그먼트를 노출 봄 가위 (정밀 과학 도구 카탈로그 번호 15000-02)를 사용 앞으로 생선의 코에 아가미의 수준에 꼬리 0.5 cm. 척수를 잘라 척수 신경 및 기타 첨부 파일을 절단하면서 고급 집게 (고급 과학 도구 카탈로그 번호 11251-30)으로 뇌를 들어, 뇌를 제거하고 (그림 1B) 폐기합니다. 남아있는 두개골 캡슐의 복부 반은 내이 (内耳) 기관을 포함하는 "그릇"을 형성한다. 각 내이 (内耳) 등 rostrally 측면 위치 utricle의 otoliths (그림 1C 및 4A)의 꼬리 끝 부분에 대칭있는 lagenas과 sacculi의 눈에 잘 띄는, 흰색, 불투명 otoliths을 관찰합니다. 모든 복부와 측면 부착을 절단하여 뼈의 그릇을 제거TS 부드럽게 고급 집게로 머리에서 그 생각을 지울 리프팅 동안. LoCaS을 (인물 1D 및 4B)가 포함 된 페트리 접시에 놓으십시오. 고급 집게 두 쌍을 사용하여 두 뼈의 측면 가장자리를 잡고 있으며 중앙에 포셉의 포인트를 삽입하고 반쪽를 떼어 내려고하면 왼쪽과 오른쪽 절반을 분리, 분해 또는 대안을 당겨 그 중간 선에서 그릇을 분리 균열 분리. 고급 포셉 (그림 2)를 사용하여 뼈에서 두 labyrinths를 제거합니다. 반원의 운하, utricles, sacculi 및 lagenas (그림 4C) : 청각 및 vestibular 최종 기관을 식별 할 수 labyrinths을 검사합니다. 각 otolith 아래의 분홍빛이 도는 지역은 세포를 포함하는 maculae 있습니다. 마찬가지로, 반원의 운하의 ampullae 내부 분홍색의 띠는 세포이있는 cupula를 식별합니다. 조심스럽게 고급 집게를 사용하여 lagena과 utricle에서 otoliths를 제거 ( <strong>도 2 및도 4C). 그것은 이렇게하면 saccular 세포에 손상을 줄 수 있으므로 saccule에서 otolith을 제거 할 필요가 없습니다. 3. 헤어 셀 절연 플라스틱 전송 피펫을 (피셔 과학 카탈로그 번호 13-711 – 오전 9시)를 사용하여, 포함 된 음식에 최종 장기를 이동 LoCaS + papain는 유체 이송의 볼륨을 최소화. 상온에서 삼십분이 솔루션에서 이러한 구조를 품다. 잠복기의 끝 부분에 NZR + BSA를 포함하는 요리로 구조를 이동하고 적어도 30 분 동안이 솔루션에 품다. 세포는 최대 4 시간이 솔루션에 건강 유지되지만 (다음 단계 참조) 분리 후 1 ~ 2 시간 후에 저하됩니다. 세포 분리를위한 준비에 NZR를 포함하는 요리로 최종 장기 중 하나를 이동합니다. lagenas 및 utricles를 들어, 부드럽게 분홍빛이 도는 상피 TI의 maculae – 시트를 발사하는 강아지 털을 사용하여세포를 (그림 3A)를 포함 ssue. maculae는 건져 할 수있는 sacculi의 otoliths 아래에서 (개 머리를 사용하여), 그리고 반원의 운하의 ampullae 내부의 위치에서 cupulae. 단계 1.4에서 조리 두 셀 절연 도구 사용하여 세포를 (그림 3B)를 포함 파편 필드를 생성 할 수있는 망막 황반 또는 cupula을 씹다. 세포에게 그것을 이동하기 전에 접시의 바닥에 정착 할 최소한의 시간이 소요됩니다. 위상 대비 광학 장착 역 현미경의 무대에 요리를 변경합니다. 40X 배율에서 세포를 관찰하고 형태의 다양성을 확인합니다. 다른 사람들이 길고 얇은 반면 대부분의 세포는 아보카도 모양입니다. 혀끝의 머리 번들의 존재는 세포로를 식별 및 위상 – 밝기는 자신의 건강을 실현할 수 있습니다. 절연 세포의 Photomicrographs는 그림 5에 표시됩니다. 4. Zebrafish 헤어 셀을 클램핑 패치 perfo를위한 준비장소 5 MG amphotericin B (시그마 A4888) 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 100 μl DMSO를 입력 : 정격 패치 녹음 5,6는 다음과 같이 amphotericin 함유 내부 솔루션을 준비합니다. amphotericin의 모든 해산 될 때까지 10~20초에 대한 즉시 와동이 솔루션입니다. 두 번째 microcentrifuge 튜브에 다음 피펫 625 μl K는 + – 내부 솔루션입니다. 위와 같이 + – 내부 솔루션 K와 소용돌이에 amphotericin 솔루션 10 μl를 추가합니다. 재고 amphotericin 솔루션은 몇 시간 지속 하나 시간 후 최종 솔루션이 삭제됩니다. 다단 풀러 (셔터 P-1000)를 사용하여 BF 150-86-10 붕규산 유리 (셔터 계측기)에서 패치 피펫을 제조. 피펫은 약 2 μm의 직경 팁이 있어야하며 표 1에서 솔루션 MΩ 1-3의 저항을 갖게됩니다. 다음과 같이 작업이 잘되어 있다는 풀러의 설정 : 열 = 램프 minus10는 = 0, 속도를 당겨 = 18, 지연 = 1, 압력 = 600. 의 모양좋은 피펫의 끝은 그림 5의 삽입 C의 사진에서 분명하다. 그들은 electrophysiological 레코딩을하는 동안 최소 액세스 저항을 제공하기 때문에 갑작스런 "총알 모양의 '피펫이 선호됩니다. amphotericin 함유 K + – 내부 솔루션으로 반 녹화 전극을 채우기 위해, 28 게이지 Microfil의 주사기 바늘 (세계 정밀 계측기 MF28G-5)를 사용합니다. 패치 클램프 증폭기의 headstage에 부착 전극합니다. -10 뮤직 비디오, 10 Hz에서 10 밀리 전압 단계를 적용하고이 셀 근처의 녹음 요리의 맨 아래로 공기 / 솔루션 인터페이스를 통해 maneuvered되고 같이 전극에 긍정적 인 압력을 유지하고 있습니다. 건강한 찾고 셀에 직교 전극을 배치합니다. 그것이 밖으로 흐르는 솔루션에서 벗어나되도록 전극이 충분히 셀 근처에있는 경우, 신속하게 전극에 약간의 진공을 적용, 압력을 반대로 그 위에 셀 "점프"까지. 즉시 일에 흡입을 중단전자 전극과 전극의 내부에 -70 mV의 개최 가능성을 적용 할 수 있습니다. 몇 초 내에 gigaohm 씰이 형성됩니다. 곧 인감 형성 한 후 표시되는 전압 단계의 시작 및 종료의 용량 현재의 과도을 관찰합니다. 과도가 (약 10 분) 최대 크기에 크기에 성장 보면서 amphotericin에 의해 전극 아래에 멤브레인의 천공을 감시하고 있습니다. , 건강한 셀에 전체 셀 (구멍) 구성의 설립을 확인 전압의 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing을 적용하여 외부 K + 전류를 유도합니다. 대부분의 세포는 눈에 잘 띄는 외부 전류를 (그림 6 참조)가 있습니다. 5. 대표 결과 그림 4는 세포 분리의 단계에서 찍힌 사진을 보여줍니다. 패널에서이 lagenas, saccluli 및 utricles와 관련된 otoliths은 throu 볼 수 있습니다GH는 뼈의 얇은 층을 overlies 것을. 이러한 불투명 한 구조 해부의 후속 단계 동안 동물에서 최종 장기의 안전한 제거에 도움 편리한 랜드 마크를 제공합니다. 패널 B는 그대로 labyrinths과 utricles, lagenas 및 sacculi의 눈에 잘 띄는 otoliths를 포함 뼈의 "그릇"을 보여줍니다. 패널 C는 뼈에서 제거되었습니다 미로를 보여줍니다. lagena에서 부채꼴 가장자리와 큰 otolith, utricle의 saccule과 콩 모양 otolith의 고드름 모양의 otolith을 확인합니다. 크기와 lagena으로부터 격리 세포에서 볼 형태의 다양성의 일부는 그림 5에 도시된다. 건강한 세포는 쉽게 날카로운 경계가있는 밝은 상으로 확인된다. 세포 모양은 약 2 클래스로 나눌 수 있습니다 : 아보카도 모양 (아보)과 긴 얇은 (thn) 각 그룹 내에서 세포의 크기가 현저하게 달라질 수 있지만 (예를 들어 아보 1 아보 3 비교). 삽입이의 클러스터를 보여줍니다에 세 세포가 완전히 서로 분리되지 않았습니다. 삽입 B에있는 세포의 블랙 색상과 세부적인 외관은 쉽게 죽은로 셀을 식별합니다. 삽입 C는 이러한 세포에서 녹화에 적절한 형태와 크기를 도시 한 패치 피펫의 끝을 보여줍니다. 그림 6에 표시된 현재의 흔적은 그림 5와 같이 아보 2와 비슷한 lagena 셀에 부과 잠재력 단계를 hyperpolarizing하고 depolarizing에 대한 응답으로 얻었다. 다양한 크기와 모양의 세포의 현재 반응은 널리 전압 개폐 채널의 보완에 다양성을 제안 다를 수 있습니다. 1-3 그림 : 세포의 분리의 단계를 설명하는 만화. 그림 1. 두개골 capsu의 제거zebrafish에서 귀에 labyrinths을 포함하는 르.. 요리를 해부에 zebrafish 등쪽면을 희생 핀. B는. 오픈 두개골은 제거하고 뇌를 폐기하십시오. C. utricles, lagenas 및 sacculi. D의 otoliths을 관찰합니다. labyrinths를 포함하는 두개골 캡슐의 복부 부분을 제거합니다. 그림 2. 두개골 캡슐에서 labyrinths의 제거.. 그 중간 선에서 두개골 캡슐을 분리 균열. B. 뼈에서 labyrinths를 제거합니다. C는. 집게를 사용하여 lagenas과 utricles에서 otoliths를 제거합니다. 그림 3. labyrinths에서 세포의 분리.. 부드럽게 교장 발사개 머리 culae. B. 두 개 머리카락과 maculae을 씹다. C.이 패치 클램프에 대한 격리 된 세포를 사용합니다. 그림 4. 이미지는 개별 셀의 고립의 단계 중에 찍은. 뇌의 제거 후 A.이 두 lagenas 및 sacculi (화살표)와 utricles (화살촉)과 관련된 otoliths를 시각적으로 할 수 있습니다. B.은 복부의 제거 후 동물의 내이 (内耳) 기관을 포함하는 두개골 캡슐의 일부. B의 오른쪽 반으로 만화는 왼쪽 utricle, lagena과 saccule의 위치를 식별합니다. 점선은 왼쪽 미로의 대략적인 위치를 나타냅니다. C. 오른쪽 미로 (중간보기) D : C에서 미로의 주요 부분을 보여주는 만화 그리기. : 앞 반원형 운하, B : 수평 운하, C : 뒤 운하, D : utricular otolith, E : saccular otolith, F : lagenal otolith. D의 스케일 바는 A와 B에 대한 1mm, C 및 D. 0.5 mm를 나타냅니다 그림 5 형태의 다양성을 보여주는 lagena에서 절연, 건강한 세포, 아보 :. 아보카도 모양의 세포, thn : 긴 얇은 세포. 삽입 세 불완전하게 격리 세포의 클러스터, 삽입 B : 죽은 세포, 삽입 C : zebrafish 세포에서 electrophysiological 레코딩에 사용되는 패치 전극의 끝. 스케일 바 = 20 μm의 주요 그림 및 모든 insets에 적용됩니다. 패치에 기록 그림 6. 요즘에는 헤어 셀을 고정. 셀에 평균 응답 (유사 t-70 mV의 개최 가능성에서 70 뮤직 비디오까지 -140 뮤직 비디오에서 10 MV 단위로인가 전압 단계의 세 프레젠테이션에 그림 5에서 O 아보 2). 더 depolarized 가능성에 나타나는 운영을 중지시키지 전류를합니다. 전압 단계 magnitudes는 흔적의 일부 옆에 표시됩니다.