La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l'antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em> E. coli</em
Summary
La biosintesi eterologa di eritromicina A attraverso<em> E. coli</em> Comprende le seguenti fasi sperimentali: 1) trasferimento genetico, 2) ricostituzione eterologa, e 3) l'analisi del prodotto. Ogni passo verrà spiegato nel contesto della motivazione, potenziale, e sfide nella produzione di prodotti terapeutici naturali usando<em> E. coli</em> Come host surrogato.
Abstract
La produzione eterologa di complessi prodotti naturali è un approccio progettato per affrontare le attuali limitazioni e le possibilità future. È particolarmente utile per quei composti che possiedono un valore terapeutico ma non può essere sufficientemente prodotto o trarrebbero beneficio da una nuova forma di produzione. Le procedure sperimentali oggetto può essere suddiviso in tre componenti: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione eterologa e 3) l'analisi del prodotto. Ogni componente sperimentale è in fase di continua ottimizzazione per affrontare le sfide e anticipare le opportunità associati a questo approccio emergente.
Biosintesi eterologa inizia con l'identificazione di una sequenza genetica responsabile di un prodotto naturale. Trasferire questa sequenza in un ospite eterologo è complicata dalla complessità via biosintetica responsabile della formazione del prodotto. L'antibiotico eritromicina A è un buon esempio. Venti geni (pari a> 50 kb) sono necessari per la biosintesi eventuale. Inoltre, tre di questi geni codificano megasynthases, multi-dominio enzimi ciascuna ~ 300 kDa nella dimensione. Questo materiale genetico devono essere progettati e trasferiti E. coli per la biosintesi ricostituito. L'uso di isolamento PCR, costruzione operone, multi-cystronic plasmidi, ed elettro-trasformazione sarà descritto nel trasferire l'eritromicina Un cluster genetico E. coli.
Una volta trasferita, la E. coli cella deve supportare biosintesi finale. Questo processo è anche impegnativo viste le differenze sostanziali tra E. coli e la maggior parte dei padroni di casa originali responsabili della complessa formazione del prodotto naturale. La cella deve fornire substrati necessari a sostenere la biosintesi e coordinately esprimere il cluster trasferito genetica di produrre enzimi attivi. Nel caso di eritromicina A, la E. coli cella doveva essere progettato per fornire i due precursori (propionyl-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA) necessari per la biosintesi. Inoltre, le modifiche di sequenze genetiche, il numero di copie del plasmide, chaperonin co-espressione, post-traslazionale modifica enzimatica, e la temperatura di processo sono stati anche tenuti a consentire eritromicina finale Una formazione.
Infine, la produzione di successo deve essere valutata. Per l'eritromicina Un caso, presenteremo due metodi. La prima è la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) per confermare e quantificare la produzione. La bioattività di eritromicina A sarà inoltre confermata mediante uso di un saggio biologico in cui viene testata l'attività antibiotica contro il Bacillus subtilis. I saggi di valutazione stabiliscono eritromicina A biosintesi da E. coli e posto le basi per i futuri sforzi di progettazione per migliorare o diversificare la produzione e per la produzione di nuovi composti naturali complessi che utilizzano questo approccio.
Introduction
Eritromicina A è un antibiotico polichetide prodotto dal Gram-positivi suolo batterio Saccharopolyspora erythraea, e la produzione di corrente è stato poco incrementato a ~ 10 g / L in decenni di mutagenesi tradizionale e protocolli di screening e più recentemente attraverso schemi di ottimizzazione di processo 1-6. Strategie di mutagenesi e screening sono comuni in antibiotico sviluppo prodotto naturale a causa di difficoltà di coltura e / o manipolare geneticamente host di produzione nativi e causa dell'attività prontamente disponibili antibiotico o fenotipi crescita migliori per facilitare la selezione. Nel caso di eritromicina A, S. erythraea è limitata da un profilo di crescita lenta e la mancanza di tecniche di manipolazione genetica diretta (relativa organismi come E. coli), quindi, ostacolando rapidi miglioramenti nella produzione e biosintesi di nuovi derivati. Dopo aver riconosciuto i problemi di produzione e sbloccato diversificatisulla possibilità con composti come eritromicina A, la comunità di ricerca ha iniziato a perseguire l'idea della biosintesi eterologa (Figura 1) 7. Questi sforzi hanno coinciso con informazioni di sequenza disponibili per l'eritromicina Un gene del cluster 8-11. Va sottolineato che il numero di sequenza cluster prodotto naturale complesso gene ha notevolmente ampliato 12-16, fornendo lo stimolo a proseguire gli sforzi biosintesi eterologa di accesso codificato potenziale medicinale. Per fare ciò, la ricostituzione eterologo richiede che il nuovo host soddisfare le esigenze della via di biosintesi specifico. E. coli fornisce la convenienza tecnico, una vasta gamma-spanning di tecniche di biologia molecolare, e le strategie di ingegneria metabolica e di processo per lo sviluppo del prodotto. Tuttavia, rispetto ai padroni di casa di produzione nativi, E. coli non presenta lo stesso livello di produzione complesso prodotto naturale. Era quindi noto se E. coli potrebbe servire come una valida opzione per il complesso eterologa biosintesi prodotto naturale. Tuttavia, si è ipotizzato che E. coli sarebbe un organismo ospite ideale se biosintesi eterologa potrebbe essere realizzato.
Con questo obiettivo in mente, gli sforzi iniziali ha cominciato a produrre l'aglicone polichetide 6 desossieritronolide B (6dEB) attraverso E. coli. Tuttavia, nativo E. metabolismo coli non potrebbe fornire livelli apprezzabili della propionil-CoA e (2S)-metilmalonil-CoA precursori necessari per supportare biosintesi 6dEB né poteva il nuovo host post-traduzionale modificare il desossieritronolide B sintasi (DEBS) enzimi. Per porre rimedio a questi problemi, una via metabolica composto da enzimi nativi ed eterologhi è stato costruito in E. coli tali che esogenamente propionato è stato alimentato convertiti intracellularmente a propionil-CoA e quindi (2S)-metilmalonil-CoA, durante la progettazione di completare questo percorso, un gene sfp è stato posto in thcromosoma e di E. coli BL21 (DE3) per produrre un nuovo ceppo chiamato BAP1. L'enzima SFP è in grado phosphopantetheinyl transferasi di attaccare il 4'-phosphopantetheine cofattore per gli enzimi DEBS 17,18. I tre geni DEBS (ogni ~ 10 kb) sono state poi poste su due vettori di espressione inducibili separatamente selezionabili contenenti promotori T7. Dopo una chiave di regolazione post-induzione temperatura (a 22 ° C), i geni sono stati DEBS coordinately espressa all'interno BAP1 in uno stato attivo in grado di generare 6dEB 19.
Il perseguimento di eritromicina A pieno biosintesi poi ha iniziato ad usare un cluster analogo gene da Micromonospora megalomicea o un percorso ibrido composto da geni di S. erythraea, S. fradiae, e S. venezuelae che ha prodotto l'intermedi eritromicina C e 6-deoxyerythromycin D, rispettivamente 20-22. Recentemente, il nostro gruppo ha esteso questi sforzi con la produzione di erythromycin A (la forma più clinicamente rilevante di eritromicina) attraverso E. coli. In contrasto con il lavoro precedente, la nostra strategia coordinately espresso il 20 originario di S. erythraea geni necessari per la biosintesi polichetide, biosintesi deoxysugar e l'attaccamento, sartoria supplementare, e di auto-resistenza (Figura 2). In totale, 26 (nativo e eterologa) geni sono stati progettati per consentire E. coli per produrre eritromicina A a 4 mg / L 23,24. Questo risultato stabilito produzione completa di un complesso prodotto polichetide naturale con E. coli e serve come base per sfruttare questa nuova opzione di produzione o l'esercizio di nuove.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fasi critiche biosintesi eterologa si riscontrano a ciascuno dei tre punti procedurali nel processo: 1) trasferimento genetico; 2) ricostituzione biosintetica e 3) l'analisi del prodotto. Un problema in qualsiasi fase farà deragliare l'obiettivo finale di creare biosintesi eterologa. Forse l'aspetto più impegnativo del processo è stabilire biosintesi ricostituita, dal momento che questo è assolutamente necessaria per consentire l'analisi di successo. Tuttavia, la ricostituzione dipende un'attenta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il NIH (AI074224 e GM085323) e NSF (0.712.019 e 0.924.699) per il finanziamento a sostegno di progetti dedicati alla biosintesi eterologa.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
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