Summary
Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von Knorpeldefekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von autologen Chondrozyten auf einer Matrix ausgesät ist eine gut akzeptierte Methode für den Umbau und die Reparatur von Gelenkknorpelläsionen Bereitstellung befriedigend langfristige Ergebnisse. Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation (MACT) bietet eine standardisierte und klinisch etablierte Methode der Implantation.
Abstract
Gelenkknorpel Mängel sind ein großes gesundheitliches Problem betrachtet, weil Gelenkknorpel hat eine begrenzte Kapazität für Selbst-Regeneration 1. Unbehandelte Knorpelschäden zu andauernden Schmerz zu führen, was sich negativ auf die Qualität des Lebens und der Prädisposition für Arthrose. In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene chirurgische Techniken entwickelt, um solche Läsionen zu behandeln. Doch bis jetzt war es nicht möglich, eine vollständige Reparatur in Bezug auf die Deckung des Defektes mit hyaline Gelenkknorpel oder eine zufriedenstellende langfristige Erholung 2-4 zu erreichen. Daher bleiben Gelenkknorpel Verletzungen ein primäres Ziel für regenerative Techniken wie Tissue Engineering. Im Gegensatz zu anderen chirurgischen Verfahren, die oft zur Bildung von Faser-oder fibrocartilagineum Gewebe führen soll Tissue Engineering zu vollständigen Wiederherstellung der komplexen Struktur und die Eigenschaften der ursprünglichen Gelenkknorpel unter Verwendung der chondrogenen Potential der transplantierten Zellen. RÜNGSTE Entwicklungen eröffnet vielversprechende Möglichkeiten für regenerative Therapien Knorpel.
Die erste Zelle Ansatz für die Behandlung von tiefen osteochondralen Läsionen oder Knorpel wurde 1994 von Lars Peterson und Mats Brittberg die klinische autologe Chondrozyten-Implantation (ACI) 5 Pionierarbeit durchgeführt. Heute ist die Technik in der Klinik zur Behandlung von großen Knorpelschaden Mängel des Knies gut etabliert, das Beibehalten der guten klinischen Ergebnisse auch 10 bis 20 Jahre nach der Implantation 6. In den letzten Jahren erlebte die Implantation von autologen Chondrozyten eine schnelle Progression. Der Einsatz eines künstlichen dreidimensionalen Kollagen-Matrix, auf der Zellen anschließend wieder aufgeforstet werden immer mehr und mehr populär 7-9.
MACT besteht aus zwei Operationen: Erstens, um Chondrozyten sammeln muss ein Knorpel-Biopsie von einem nicht belasteten Bereich der Knorpel t durchgeführt werden,er Kniegelenk. Dann werden Chondrozyten, die extrahiert, gereinigt und erweitert werden, um eine ausreichende Anzahl von Zellen in vitro. Chondrozyten werden dann auf eine dreidimensionale Matrix ausgesät und anschließend wieder implantiert werden. Bei der Herstellung einer Tissue-Engineering-Implantat sind Proliferationsrate und Differenzierung Kapazität von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Geweberegeneration 10. Verwendung einer dreidimensionalen Matrix als Zellträger wird angenommen, dass diese zellulären Merkmale 11 zu unterstützen.
Das folgende Protokoll wird zusammengefasst und zeigen eine Technik zur Isolierung von Chondrozyten aus Knorpel Biopsien, ihre Proliferation in vitro und deren Aussaat auf einer 3D-Matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Schweiz). Schließlich wird die Implantation der Zell-Matrix-Konstrukte in künstlich geschaffenen Knorpeldefekten eines Kaninchens Kniegelenk beschrieben. Diese Technik kann als eine experimentelle Einstellung verwendet werdenfür weitere Experimente von Knorpel zu reparieren.
Protocol
A. Knorpelbiopsie (Operationssälen; Schritte 1-5 in Non-sterile Zubereitung Zimmer)
- Führen Sie eine letzte Gewichtskontrolle des Kaninchens (New Zealand White Kaninchen, weiblich, 3,5-4,0 kg Körpergewicht, 6 Monate alt), um in der Lage sein Dosis Medikamente richtig und Gewicht im Anschluss an Operation zu überwachen.
- Induce Anästhesie der Kaninchen durch eine intravenöse Injektion von 10 mg / kg Propofol.
- Nach der Intubation Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5 mg / kg / min Propofol und 0,05 mg / kg Fentanyl intravenös. Überwachen Anästhesie mit Kapnographie, Pulsoximetrie und Pulsfrequenz.
- Rasur das Knie auf mit einem elektrischen Haarschneider und Vakuum das Fell betrieben werden.
- Desinfizieren Sie die Knie rasiert gründlich und decken den Rest der Kaninchen mit einem sterilen Verband.
- Ertasten Sie die Patella und führen Sie einen Hautschnitt medial der Patella.
- Öffnen Sie das Kniegelenk durch eine medial parapatellaren Arthrotomie unter sterilen Bedingungen. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden jede kleine suoberflächlichen Blutgefäße.
- Anschließend verdrängt man das Patella seitlich.
- Überprüfen Sie das Kniegelenk für irgendwelche Anomalien und makroskopischen Knorpelschäden.
- Sie vorsichtig kleine Stücke Knorpel (2-3 mm) aus der Trochlea ossis femoris mit einem sterilen Skalpell (Abbildung 1).
- Unmittelbar platzieren diese Knorpel Biopsien in einen 50-ml-Tube mit Vollmedium (DMEM + 10% fötalem Kälberserum (FCS) + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep)) mit der in-vitro-Kultur direkt nach der Operation fortgesetzt.
- Reinigen Sie die Mängel und spülen Sie sie mit steriler Kochsalzlösung.
- Positionieren Sie die Patella in der Trochlea Groove.
- Wundverschluss in Schichten mit einzelnen Knopf Nähte (4-0 Vicryl) und einer fortlaufenden Hautnaht (4-0 Monocryl). Verwenden resorbierbares Nahtmaterial.
- Schließlich versiegeln die Wunde mit einem Spray Dressing wasserdampfdurchlässig.
B. In-vitro-Kultur
- Verarbeiten Sie die Biopsie cartilage Stücke so bald wie möglich nach der Operation in einem sterilen laminaren Strömung Gewebekulturabzug.
- Waschen Sie die sterile geerntet Knorpel 2x in PBS mit anschließender Zentrifugation bei 500 xg für 3 min bei RT.
- Cut Knorpel in Stücke von 1 mm 3, Transfer in ein 50 ml Falcon und verdauen sie auf einem Schüttler für 30 min mit 10 ml Trypsin-EDTA (0,25%) und 10 ml PBS für 30 min
- Nach 30 min stoppen Trypsinierung indem Vollmedium. Dann schütteln die Knorpelstücke für eine andere für 12 Stunden mit Kollagenase A (0,21 U / mg) in serumfreiem Medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Zentrifugieren der resultierenden Lösung bei 170 × g für 3 min bei RT.
- Resuspendieren Zellpellets in 5 ml Vollmedium.
- Seed die isolierten Chondrozyten auf 25 cm 2 Gewebekulturflaschen in 5 ml Vollmedium und halten in einer befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Wachsen Chondrozyten bis zu einer Dichte von 80%.
- Lassen Sie die Zellen fROM Kolben durch Waschen in PBS 2x vor der Belichtung bis 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min. Sobald Chondrozyten lösen, stoppen Trypsinierung durch Zugabe von 10 ul Vollmedium.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 300 xg (3 min) und Pellet in Vollmedium.
- Seed Zellen in Gewebekulturflaschen (75 cm 2) und getrennte in einem Verhältnis von 1:3 (~ 5.000 Zellen / cm 2) jeder 5. Tag oder bei 80% Konfluenz.
- Bestimmen Zellzahlen und die Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung.
C. Zell-Aussaat von der Matrix
- Vor der Implantation Wasch-und Release-Zellen wie oben beschrieben. Führen Zellzahl und übertragen 5 x 10 4 Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen. Dann bei 500 xg zentrifugiert 5 min bei RT.
- Pellet in 15 ul Komplettmedium für eine vollständige Sättigung der Matrix.
- Schneiden Sie die Doppelschicht Kollagengerüsttechnologie zu den genauen Abmessungen des trochlearen Defekt durch eine sterile BiopsiePunsch.
- Platz Matrix in einem passenden Gewebekulturplatten (z. B. 24-Well-Platten).
- Seed Zellen auf dem porösen, zelladhäsiven Seite der Matrix. Dies hält die Zellwanderung weg von der Matrix.
- Lassen Zelle ausgesät Matrizen ohne weitere Zellkulturmedium in einem Inkubator für 1 Stunde in voller Einhaltung der Chondrozyten zu ermöglichen.
- Dann erfolgt Zell-Matrix-Konstrukte in Kulturbehälter (z. B. 24-Well-Platten) mit frischem vollständigem Medium. Achten Sie darauf, nicht zu waschen alle Zellen aus der Matrix, obwohl starke Haftung wird erwartet.
- Jetzt können Zell-Matrix-Konstrukte der Operation Raum für Re-Implantation entnommen werden.
D. Matrix-assistierte autologe Chondrozyten-Transplantation
- Führen parapatellaren Arthrotomie zur kontralateralen Knie wie oben (A. 1-8) beschrieben.
- Erstellen Sie zwei isolierten Knorpeldefekten im Trochleagrube mit steriler Luft operating Bohrmaschine (3,6 mm Durchmesser).
- Reinigen Sie den Fehler und gründlich mit steriler Kochsalzlösung.
- Es sollte darauf geachtet, nicht die Markhöhle jederzeit öffnen. Falls erforderlich, versiegeln den Boden der Defekte bei elektrischen Brenneisen gegen Blutungen.
- Implantat die Matrizen mit den kultivierten Chondrozyten mit der porösen Seite nach unten (Abbildung 2) ausgesät. Dann in die Bohrlöcher eingepresst und bündig die umgebende Oberfläche.
- Verschließen Sie die implantierten Matrizen mit ein wenig Fibrinkleber (Tissucol Duo S), um eine sichere Befestigung zu gewährleisten.
- Nach Gerinnung, verlagern die Kniescheibe im Trochleagrube und gelten vollen Bewegungsumfang des Kniegelenks ein paar mal.
- Anschließend verdrängt man das Patella seitlich nochmals überprüfen und für jede Veranstaltung oder Zeichen der instabilen Fixierung. Die Matrizen müssen noch an ihrem Platz gehalten werden.
- Ersetzen Sie die Patella wieder und beenden Sie den Vorgang mit Wundverschluss in Schichten und Spray Dressing wie oben beschrieben.
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Representative Results
Die beschriebene Operationstechnik ermöglicht eine erfolgreiche Isolierung und die Implantation von autologen Chondrozyten in ein künstliches Knorpeldefekt. Der experimentelle Aufbau ergab eine erfolgreiche Integration des Implantates in den umgebenden Knorpel.
Nach 12 Wochen in vivo wurde der Knorpeldefekt durch Reparatur Gewebe mit einer homogenen und intakte Oberfläche, die Schubspannung und Schäden an dem Implantat (4) reduziert gefüllt. Außerdem wurden keine Hypertrophie oder Verkalkung des Implantates ersichtlich. Die Reparatur Gewebe zeigte eine steif und solide Qualität, die vergleichbar mit dem umgebenden gesunden Knorpelgewebe war. Dies war ein wichtiger Aspekt, da erhöhte Last an dem benachbarten Knorpel aufgrund unzureichender biomechanischen Eigenschaften des Implantats das Risiko einer Frühgeburt Degeneration wäre. Darüber hinaus wurde ein Transplantat Delaminierung nicht aufgetreten. Nachdem die Membran geschnitten auf die gleiche Größe des Defekts präoperativ, jede fissuRing oder Spalten zwischen Implantat und umgebenden Knorpel wurden vermieden.
Abbildung 1. Monolayer von Chondrozyten primären Kultur bei 80% Konfluenz.
Abbildung 2. Taking a Knorpelbiopsie aus der Trochlea Groove.
Abbildung 3. Künstlich geschaffene trochlearen Knorpeldefekts.
Abbildung 4. Eröffnet Kniegelenk 12 Wochen nach Implantation einer Membran mit autologen Chondrozyten in einem pre ausgesätGebohrt Knorpeldefekt (roter Pfeil).
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Discussion
Das vorgestellte Protokoll bietet eine etablierte 9,12,13 und leicht reproduzierbar Technik autologen Chondrozyten für nachfolgende Proliferation und Re-Implantation in künstlich geschaffenen Knorpelschäden in Knie Kaninchen isolieren. Die Verwendung von autologen Chondrozyten für Umbau und Reparatur von Gelenkknorpel Läsionen ist bereits in der klinischen Anwendung bieten befriedigende Langzeitergebnisse 6.
Große Probleme wie beispielsweise Periost Hypertrophie und Kalzifizierung Delaminierung Transplantat oder Entnahmemorbidität mit der ersten und zweiten Generation von autologen Chondrozyten 14 aufgetreten ist. Daher haben Forscher Techniken unter Verwendung von exogenen bioresorbierbaren Materialien Chondrozyten des Mangels vor Ort liefern entwickelt. Die positive Wirkung von dreidimensionalen Kultursystem auf die Wartung der chondrozytische Eigenschaften wurde wiederholt gezeigt, zum Beispiel bei der Verwendung von Agarose 15, Poly - dioxanon und Polyglactin 16, Polyester Poly (L-Lactid) (PLLA) und Poly (D, L-lactid-coglycolid) (PLGA) 17, 12 Fibrin, Hyaluronsäure 18, 19 Alginat, Kollagen 20 oder Kollagen-Matrices 9 .
Die Doppelschicht Kollagenmembranmaterial Chondro-Gide in dieser Studie verwendet wurde erfolgreich in mehreren präklinischen Studien vor 9,21,22 angewendet und ist bereits Teil des klinischen Anwendungen 21,23. Die Struktur der Doppelschicht Kollagenmembran bietet eine stabile Mikroumgebung für Chondrozyten Integration und Proliferation, ermöglicht eine gleichmäßige Verteilung der Zellen innerhalb der Matrix und beseitigt die Möglichkeit, Zellleckstromcharakteristikfunktion wie es in herkömmlichen ACI 11 zu sehen ist. Durch Verwendung dieser MACT Technik werden die transplantierten Knorpelzellen lokal beibehalten Lebensfähigkeit beibehalten. Matrix-unterstützte autologe Chondrozyten Transplantation führt zur Synthese vonKnorpel-Regeneration, wie Gewebe und ist klinisch anwendbar 21.
Die beschriebene Tiermodell ist in der Behandlung von experimentellen Gelenkknorpelläsionen 11,24,25 akzeptiert. Jedoch ist die Übersetzung der klinischen Routine möglicher Ergebnisse von Experimenten mit dem vorgestellten Verfahren aus mehreren Gründen schwierig. In einem Tiermodell ist es fast unmöglich zu erreichen oder nicht Teilbelastung in den ersten Tagen / Wochen nach der Operation, die in der Regel zu empfehlen, damit die implantierten Zellen mit frühen Integrationsprozesse beginnen würde. Vollbelastung unmittelbar nach der Operation könnte möglicherweise schädlich für die Transplantation und damit könnte das Ergebnis zu beeinflussen. Aber diese Einstellung war in allen Tiermodellen vergleichbar 9,12. Experimente mit größeren Tieren, mehr ähnelt die menschliche Situation, sind in weiteren Tierstudien gerechtfertigt.
Zusammenfassend jedoch eine e etabliertxperimental Tiermodell, wie er oben beschrieben ist eine Grundlage für die weitere experimentelle Studien Knorpelreparatur und vielleicht sogar erleichtern die Realisierung und Durchführung von komplexen Studie Einstellungen. Experimentelle Untersuchungen mit Wachstumsfaktoren, Geninduktion und wechselnden Matrix Eigenschaften mit Hilfe dieses Tiermodell könnte hilfreich sein, um die etablierten klinischen Umgebungen zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HE 4578/3-1) gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
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