في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة مفيدة لدراسة يجند القناة الايونية بوابات وظيفة الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح معزولة تماما. هذا الأسلوب ينطوي على استخدام المخدرات micropipette مليئة للاستخدام الموضعي من الأدوية إلى الخلايا العصبية باستخدام معيار تقنيات سجلت المشبك التصحيح.
تعاطي التبغ يؤدي إلى مشاكل صحية عديدة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب وانتفاخ الرئة، والسكتة الدماغية. الإدمان على تدخين السجائر هو اضطراب السائد العصبية والنفسية التي تنبع من الإجراءات الفيزيائية الحيوية والخلوية من النيكوتين على مستقبلات النيكوتين أستيل (nAChRs) في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. فهم أنواع فرعية مختلفة nAChR التي توجد في مناطق الدماغ ذات الصلة لإدمان النيكوتين هو أولوية رئيسية.
التجارب التي تستخدم تقنيات الكهربية مثل المشبك التصحيح خلية كاملة أو ثنائية القطب التسجيلات المشبك الجهد مفيدة لتوصيف الدوائية للnAChRs المصالح. يتم عزل الخلايا جسديا nAChRs التعبير عن مثل الثدييات خلايا البويضات أو زراعة الأنسجة القيطم المورق، وبالتالي فهي تدرس بسهولة باستخدام أدوات علم الأدوية الحديثة. وقد أحرز تقدم كبير باستخدام هذه التقنيات، وخاصة عندما كان معروفا بالفعل لمستقبلات الهدفوقد تحقق بسهولة الثانية خارج الرحم التعبير. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، فمن الضروري دراسة nAChRs في بيئتها الأصلية: في الخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح تحصد تماما من الفئران المختبرية أو الفئران. على سبيل المثال، الفئران معربا عن "الحساسية" مفارز nAChR مثل الفئران L9'A α4 1 و الفئران α6 L9'S 2، تسمح لتحديد لا لبس فيها من الخلايا العصبية على أساس التعبير الوظيفية من حدة فرعية nAChR محددة. على الرغم من القيام به بشكل روتيني خلية كاملة التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ من قبل شرائح الكهربية المهرة، فإنه يمثل تحديا لتطبيق محليا المخدرات مثل النيكوتين أستيل أو إلى داخل الخلية سجلت شريحة الدماغ. التخفيف من المخدرات إلى superfusate (تطبيق حمام) لا يمكن عكسها بسرعة، ولا U-أنبوب نظم تتكيف بسهولة للعمل مع شرائح الدماغ.
في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لتطبيق بسرعة nAChR-تفعيل المخدرات إلى الخلايا العصبية المسجلة في م الكبار[أوس] شرائح الدماغ. يتم إجراء القياسية خلية كاملة من الخلايا العصبية في التسجيلات شرائح، وناور لmicropipette الثانية المملوءة دواء من الاهتمام إلى موقف بالقرب من الخلية المسجلة. حقنة من الهواء المضغوط أو النيتروجين خامل في ماصة المخدرات مليئة يسبب كمية صغيرة من المخدرات حل يمكن إخراجه من ماصة على الخلية المسجلة. باستخدام هذا الأسلوب، nAChR بوساطة تيارات قادرة على أن تحل بدقة ميلي ثانية واحدة. يمكنك بسهولة تطبيق مرات المخدرات أن تختلف، ويمكن سحب ماصة المخدرات مليئة واستبدالها ماصة جديدة، والسماح لأن يتم إنشاء منحنيات التركيز والاستجابة لالخلايا العصبية واحدة. على الرغم من وصفها في سياق بيولوجيا الأعصاب nAChR، ينبغي أن تكون مفيدة هذه التقنية لدراسة أنواع عديدة من القنوات الأيونية يجند بوابات أو المستقبلات في الخلايا العصبية من الدماغ شرائح.
الأسلوب الواردة في هذه الوثيقة على نطاق واسع هو مفيد لدراسة يجند القناة الايونية بوابات ظيفة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. ومع ذلك، هناك عدد من العوامل التي من شأنها أن تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية واستنساخ البيانات التجريبية التي تنتج عن استخدام هذه الطريقة. عل…
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة DA030396. بفضل أعضاء المختبر Drenan للمناقشة ونقد مفيدة للمخطوطة. ران مي شكر خاص لكيم للمساعدة التقنية وجوناثان تينغ توماس للمشورة بشأن الكبار شرائح مخ الفأر.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
N-Methyl D-glucamine | Sigma | M2004 |
KCl | Sigma | P3911 |
NaH2PO4 | Sigma | S9638 |
NaHCO3 | Sigma | S6014 |
HEPES | Sigma | H3375 |
glucose | Sigma | G5767 |
Na+ ascorbate | Sigma | A4034 |
thiourea | Sigma | T8656 |
Na+ pyruvate | Sigma | P2256 |
MgSO4•7H2O | Sigma | 230391 |
CaCl2•2H20 | Sigma | 223506 |
NaCl | Sigma | S9625 |
Na+ pentobarbital | Vortech Pharmaceuticals | 76351315 |
potassium gluconate | Sigma | G4500 |
EGTA | Sigma | E3889 |
Mg-ATP | Sigma | A9187 |
GTP | Sigma | G8877 |
DSK-Zero 1 Vibrating slicer | Ted Pella, Inc. | |
P-97 Flaming/Brown micropipette puller | Sutter | |
RC-27 Recording chamber | Warner | |
TC-344B Perfusion heater controller | Warner | 640101 |
SH-27B Solution heater | Warner | 640102 |
Nikon FN-1 | Nikon | |
C-7500 CCD Video camera | Hamamatsu | |
Picospritzer III | General Valve Co. | |
MP-285 Micromanipulator | Sutter | |
PA-100 Piezoelectric translator | piezosystem jena, Inc. | |
12V40 piezo amplifier | piezosystem jena, Inc. | |
Axopatch 200B | Molecular Devices Corp. | |
Digidata 1440A | Molecular Devices Corp. |