Summary
遺伝的に全体の内の上皮細胞を操作する技術
Abstract
分枝形態形成することは、多くの臓器の開発中に発生し、マウス胎児の顎下腺（SMG）は、分枝形態形成の研究のための古典的なモデルである。 -最終的に口腔1に、それぞれ、唾液を生産し、変更/輸送するために役立つ腺やダクトの複雑な分岐鎖のネットワークを生じさせるために、上皮芽とダクト形成のステップを反復開発SMGでは、このプロセスが含まれます3。細胞および分子イベントがコーディネートされている方法が、これらの細胞によって産生される間葉細胞、成長因子や細胞外マトリックスを含む上皮関連基底膜と間葉コンパートメントの側面は、、、、分岐メカニズムに不可欠な貧弱4を理解して残っている。分子メカニズムの研究では、上皮の形態形成の進歩の発達メカニズムの理解を推進し、可能レーゲナーへの洞察を提供ative医学的アプローチ。このような研究は、唾液上皮の遺伝子操作のための効果的な方法が不足しているため妨げられてきた。現在、アデノウイルス形質導入は 、in vivo 5 で成人腺上皮細胞を標的とするための最も効果的な方法を表しています。しかし、胚外植片に、緻密間葉と上皮細胞を取り巻く基底膜は、上皮細胞へのウイルスのアクセスを妨げている。間充織が削除された場合は、上皮はアデノウイルスを用いてトランスフェクトすることができ、および上皮初歩はマトリゲルまたはラミニン-111 6,7の存在下で分岐形態形成を再開することができます。間葉フリー上皮原基の成長はまた、可溶性増殖因子と追加の補充を必要とし、それをそのまま腺8で発生したような完全に分岐形態形成を再現していません。ここでは、トランスフェクトされたeの上皮細胞と文化のアデノウイルス形質導入を容易にする技術を説明関連した間充織とpithelium。胚のサブマシンガン、間葉の除去、およびGFP含有アデノウイルスによる上皮のウイルス感染の顕微解剖に続いて、我々はそのままSMG腺構造をrecapitulatingと分枝形態形成、上皮が自発的に感染していない間充織と再結合することを示している。蛍光タグ付きアデノウイルスコンストラクトが使用されている場合、遺伝的に修飾された上皮細胞集団は簡単に、標準的な蛍光顕微鏡法を使用して監視できます。ここで説明された組織の組換え方法は、現在、トランスジェニック動物の生成を必要としない複雑な3次元組織構築物内に野生型または変異型ベクターを用いた上皮細胞のトランスフェクションのための最も効果的かつアクセス可能な方法である。
Protocol
プロトコルは、 図1に示した4つの主要な手順が含まれています。すべての手順が完全に詳細に記載されています。アデノウイルスの構築およびウイルス精製は解剖上皮初歩の遺伝形質で使用するための臓器摘出の前に実行する必要があります。アデノウイルスを扱うときは、すべての標準的なBSL-2の安全上の予防措置に従うべきである。
1。マウス胚性顎下腺（SMG）の収穫と顕微解剖
- 胎生13日目のマウス胚の頸椎脱臼や収穫列（E13、3-5上皮芽）制度の動物実験委員会によって承認され、次の手順に続いて、CO 2ナルコーシスを使用してタイムアウト妊娠雌マウス（非近交系の系統のCD-1またはICR）を、安楽死させる委員会。膣栓の発見の日は、E0として指定されています。始まったばかりクレフトを持つ単一の主芽と茎がある場合には唾液腺もE12の段階で収穫し、培養することができる開始します。この前のステージにサブマシンガンは、ここで示されたものとは異なる培養条件が必要です。
- フェノールレッド（Life Technologies社）および100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlストレプトマイシン（ペン連鎖球菌を欠いたDMEM /ハムF12培地（F12）25mlを充填した無菌の10cmの組織培養皿に胚の文字列を転送する、ライフテクノロジーズ）。
- 滅菌メス（＃11ブレード）や鉗子（＃5、ファイン科学ツール、11252から20）を使用して、DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の25ミリリットルを含む別々の10cm皿に嚢から胚を取り除く。
- ちょうど下顎下の斜めのカットで胚の頭部を切断。
- 上顎下のカットを使用した透過光ベース（ニコンSMZ645または同等品）を装備するステレオ解剖顕微鏡下で頭から下顎を分離します。ガラスの余分な部分の上に直接ではなく、顕微鏡ベースのガラス成分に組織を置く。
- DMの3ミリリットルに下あごを収集無菌35mmの組織培養皿の中EM/F12 +ペン連鎖球菌。
- 舌がスライスの底面にありますが、12時00時の位置に向かって指しているので、解剖顕微鏡ステージ上顎骨スライスを置きます。
- シザリング動きの2つの交差したピンセットの片側を使って、下顎のスライスの下1/3を削除し、破棄します。
- 右（右利きの場合）にスライス90°回して、ピンセットではさみカットを使用して、途中でスライスに下顎骨スライスの先頭部分（舌を切断せずに）切る。
- 離れて余分な組織をはがし、下にサブマシンガンを露出させるためにそれを削除します。舌の付け根付近各側に1つあるでしょう。
- 舌でティッシュを押したままにする鉗子の1ペアを使用して、舌からSMGを離れていじめるために他の鉗子を使用しています。他の腺について、この手順を繰り返します。
- 新しい無菌の35ミリメートル組織にDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の3ミリリットルに顕微唾液腺を収集培養皿。注意：以前に2,8を説明するように、接続され小さい舌下腺（1芽）と共に大きく顎下腺は（3-5上皮芽）、4と実行手順4.1、4.3、および4.4のステップにスキップすることにより無傷で培養することができる。
2。上皮性原基の分離をSMG
- 場所5（またはそれ以上）のハンクス平衡塩溶液（HBSSはCa + +やMg + +のを欠いて 、200μlを含むガラス底、直径50mmのマイクロウェルディッシュ（マテック株式会社、P50G-1.5-14-F）の中に唾液腺Life Technologies社）を0.4％含有する（v / v）のディスパーゼ（Life Technologies社、カタログ番号17105から041）と、37℃で15分間インキュベート℃、
- インキュベーション後、200μlの滅菌ピペットチップを用いて、慎重に腺を乱すことなくディスパーゼソリューションを吸引します。直ちにディスパーゼを中和するために5パーセントを含むDMEM/F12培地200μlの（w / v）BSAを（DMEM/F12-BSA、0.22μmのフィルターで滅菌済み）を追加します。 <liは>解剖顕微鏡下では、細かいヒント（＃5 Dumostar、ファイン科学ツール、11295から20）とピンセットを使って、優しく上皮をそのままにしておくように注意しながら、SMGの上皮芽やダクト周りから緩めの間充織を分離。
- DMEM/F12-BSAメディアやそっとでプリウェット滅菌200μlのピペットチップはDMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを含む新しい50mm径のマイクロウェル皿に上皮初歩を移します。滑らかなエッジを持つ高品質の200μlのピペットチップを使用しています。
- 間葉片が含まれている皿の中で、舌下腺、デタッチされた顎下腺のつぼみを含む、任意の非間葉組織を捨てる。
3。上皮初歩のアデノウイルス感染
- 得られた溶液の力価は1×10 8〜10 9 PFUsなるようにマイクロチューブにDMEM/F12 +ペン連鎖球菌に興味のあるアデノウイルスを希釈することにより、ウイルス感染の媒体の200μlを加える。ザ異なるウイルスに要する最適な力価は変わる場合があります。塩化セシウム（セシウム）に精製された最適な取り込み効率のためのウイルス調製物を使用することが重要です。
- 5上皮初歩を含む皿からメディアを取り出します。すぐにすべての回で基礎が濡れ保ち、感染メディアの200μlを添加する。ウイルスを処理し、汚染されたピペットチップの処分に必要な予防措置を取る。 10％漂白剤溶液を用いて、任意のウイルスに汚染された表面を消毒してください。
- くっつくのを防ぐし、それらがプレートの底に沈殿できるように鉗子で互いに離れ上皮初歩を移動します。室温で1時間ウイルスメディアの初歩をインキュベートする。彼らが近くに一緒に移動した場合のインキュベーションの間に、基礎を分離します。過度の揺れや動きが腺が一緒に凝集することができます。
- インキュベーション後、そっと、ウイルス含有培地を除去し、適切に廃棄し、rを混乱させないように注意しながらudiments。 DMEM/F12 +ペン連鎖球菌の200μlを添加する。この洗浄は、少なくとも2回以上繰り返すとDMEM/F12 +ペン連鎖球菌メディア200μlと交換してください。これらの洗浄は強く上皮に添付されていない任意のウイルスを除去し、間充織の感染を防ぐために重要です。
- DMEM/F12 200ml中で20分間、2％（v / v）のマトリゲル（BD Biosciences社、356231）を含有する上皮初歩をインキュベートする。我々は、マトリゲルでこの短いインキュベーションは、初期培養期間中に既存裂の退縮を最小限に抑えますが、マトリゲルへの暴露が望まれていない場合は、このステップを省くことができますを見つける。
再結合サブマシンガンの4。 エクスビボ文化
- ノッチ（小カット）の上に、プリウェット200μlのピペットチップを用いて、各原基を、一つずつ置く13ミリメートル、0.1μmの培地を200μl（浮かんNucleporeトラックエッチメンブレンフィルター（ワットマン）ガラス底マイクロウェルプレートに5初歩/フィルタ）。培地次のとおりです。DMEM/F12 +ペン連鎖球菌は、50μg/ mlのトランスフェリンおよび150μg/ mlのアスコルビン酸を含む、前述のように2,8は 。トランスフェリンは生存を刺激することが知られており、唾液腺や他の器官外植片9の分枝形態形成されています。アスコルビン酸の添加は、SMGは分岐を刺激することが示されている図10は、それが代謝経路（例えば、コラーゲン線維の形成11時プロリン水酸化など）の多くの水酸化反応における補因子として作用することが知られ、また、他の臓器の外植片におけるフィブロネクチンおよびラミニン産生を刺激される12。
- 各上皮原基を追加した後、できるだけフィルターの上にできるだけ多くのメディアを取り出します。小さいメディアは初歩の配置を行い、はるかに容易に間充織間フィルターの上にあまりにも多くのメディアは、フィルタがシンクすることがあります。余分なメディアをピペットチップでまたは先端間のメディアを把持する鉗子を使用することによって、削除することができます。
- あちこち由来間葉片を置きメートル上に三から四腺および/または各上皮性原基の周りに。離れて初歩から間葉の動きを避けるために、腺を取り囲んでいる余分なメディアを取り出します。有益ではありませんが、あまり上皮原基の成長に有害であることができるより多くの腺由来間葉。
- 必要に応じて、48 -72時間37℃加湿インキュベーター（95％空気/ 5％CO 2）内で再結合サブマシンガンをインキュベートする。
- 明視野および/または蛍光0時間でのライブ腺の画像（必要な場合）、組換え後2時間およびに4Xまたは5X倍率の対物レンズを使用してデジタルカメラを装着し、倒立正立、またはステレオの光学顕微鏡でその後は24時間を取得するビューの1つのフレームに再結合された全体の腺をキャプチャします。唾液腺の画像は、明の設定や（完全に自動化された顕微鏡では不可能である）光路内の途中に配置され、適切な位相リングのいずれかを使用して最高のコントラストを示す。標準位相コントラストは、noです腺が厚いとコントラストを作成するので、トン必要。
- 希望の時点では、再結合されたサブマシンガンが良いで細胞を維持することにより、内部細胞構造を維持するために5％（w / v）スクロースを（含む1X PBS中2％パラホルムアルデヒド（PFA）製の固定液で20分間固定することができます等浸透圧性の状態）。固定剤が完全に固定した後に削除された場合は4％PFA、2％とは違ってPFAは、GFPシグナルのかなりの量を保存します。腺を4℃の暗所で1×PBSで1週間まで保存することができる°Cのホールマウント免疫細胞化学と共焦点イメージングが実行されるまで、前述3,6,13-15報告した。理想的には、免疫細胞化学およびイメージングは、最高品質の画像を得るために固定した後すぐに実行する必要があります。腺はまた、ウエスタンブロット分析に続いて、SDS-PAGE用のRIPA緩衝液で溶解することができる。
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Representative Results
主要な実験手順のフローを図1に概説されています。無傷のSMGは、隔離された原基上皮、およびそれに対応する間充織の例を図2に示す。ときに指示された時間のために培養されたex vivoで分岐形態形成を継続して受ける組み換えられたサブマシンガンの明視野像を図3に示す。上皮GFPを発現している48時間成長させ再結合腺が図4に示されている。組換えサブマシンガンの共焦点イメージが固定され、撮像された免疫細胞化学続く文化の中で72時間後に、 図5に示されています。上皮マーカー、E-カドヘリンは、GFP発現周囲の間充織から上皮細胞集団の境界が設定されます。上皮の周囲に局在基底膜タンパク質、パールカンの検出は、再結合された腺の基底膜の少なくとも部分的な再構成を示しています。Figure 6。副交感神経顎下神経節神経突起伸長を受け、以前に実証されるように組換え培養における腺を支配する19
図1：（）フローチャート及び（B）の回路図は、主要な実験的なステップを示す。
舌下腺上皮（SL EPI）と間充織（MES）に囲まれた顎下腺上皮（SMGエピ）を示す（A）は全体の胎生13日（E13）唾液腺の図2。明視野像。 （B）は、絶縁型上皮の原基、及び（C）を分離間葉。スケールバー=100μmである。
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図3：指示された時間のためにex vivoで培養で増殖充織の作品に囲まれた上皮初歩の明視野像（白破線で概説）。上皮細胞は、分枝形態形成受けると間葉結露は培養液中で24時間早ければ明らかである。スケールバー=100μmの
唯一の上皮細胞は（白破線で概説）48時間GFP発現アデノウイルスと培養のex vivoで感染させた組換えサブマシンガンの図4。明視野（）、蛍光（B）とオーバーレイ（C）の画像。スケールバー=100μmである。
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図5（A）は核（DAPI、青色）、アデノウイルスのGFP（緑色）、上皮マーカーで標識された組換えサブマシンガンの共焦点画像や明視野画像（BF）。 E-カドヘリン（赤）、スケールバー=250μmの、または、（B）の核（DAPI、青色）、アデノウイルスのGFP（緑色）、上皮マーカー、E-カドヘリン（赤）、基底膜マーカー、パールカン（シアン）、スケールバー=50μmである。白い線が上皮を概説破線。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6：副交感神経顎下神経節神経突起伸長を受け、組換え培養、スケールバー= 250μmで腺を支配する。
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Discussion
ex vivoでの上皮間葉組換え技術は、1981年に初めて16で顎下唾液腺のために公開されていました。このプロトコルでは、再結合された腺のコンテキスト内で上皮細胞の遺伝子発現を操作するためにアデノウイルス感染を用いて、元のメソッドを拡張。感染している細胞の割合は、ウイルスプロモーターの性質、ウイルス力価およびウイルス純度に依存するのに対し、我々は、上皮細胞の割合は、アデノウイルスに感染していることを示している。我々は、それが効率的な上皮伝達にCsCl勾配精製されたウイルスを使用することが必要であることを発見した、の精製は、ここでは説明しません。我々はまた、組換え（データは示していない）の前に間葉細胞に感染することができましたので、間葉系人口の独立した遺伝子操作も可能です。我々は最近、役割を識別するためにこのアデノウイルストランスフェクション/組織組換え法を用いて極性タンパク質は、PAR-1Bため、唾液腺の開発における上皮による基底膜の配置の制御インチキナーゼデッドPAR-1bはアデノウイルスと野生型のPAR-1bのアデノウイルスは上皮初歩を感染させるために、本 研究で使用されて13とE13 mesenchymesと再結合した両方。特定の分子の機能を調べるために変異ウイルスを使用する能力は、大幅にこの方法の有用性を高める。
間葉コンパートメントに影響を与えることなく、そのまま胚性唾液腺の上皮細胞集団内の特定の分子を標的とする効果的なツールの欠如が現在あります。複数の研究が無傷器官培養におけるシグナル伝達を操作する薬理学的阻害剤を使用していたが、これらの阻害剤は、上皮と間葉の両方に影響します。直接上皮に対する阻害剤の効果を評価するために、上皮の初歩をマトリゲルOのいずれかで間葉の非存在下で培養する必要がありますRラミニン-111ゲル6,7。小さ な阻害性RNA（siRNA）は、siRNAが最も優先的に脂質担体13,14,17,18の存在下で上皮細胞に取り込まれているので、上皮遺伝子発現をダウンレギュレートするための効果的な方法です。ただし、どちらの方法をタンパク質レベルまたは機能を妨害するため、野生型または変異型遺伝子の過剰発現を可能にする。胚全体SMG文化の伝統的な（非ウイルス性）をトランスフェクションの試みは、上皮細胞の数が少ない（ML、未発表データ）対象とすることができるという点である程度の成功を収めた。比較では、アデノウイルス形質導入は、特に唾液腺上皮細胞をトランスフェクトするための効果的な方法を表しています。
副交感神経は、最近5ケラチン陽性前駆細胞集団19を維持することにより、分岐正常唾液腺のために重要であることが示されている。 MESを介してこの組織の組換え方法の利点enchymeフリー上皮原基培養法は、副交感神経節は、組換え培養系で維持することができるということです。主要な上皮ダクト19に隣接して間葉に位置する副交感神経節のおおよその位置を慎重に追跡することで、各原基がアップガングリオンに関連付けられて終わることを保証することが可能である。しかし、我々は、常にではありませんがそのまま変更されていない場合と同じに、すべての上皮性原基とmesenchymesの価値が3から4腺を組み合わせることにより、それぞれの原基がある程度（ 図6）に蕾を刺激するのに十分な神経に関連付けられていることを見つける腺。
無傷腺のコンテキストで上皮に感染するための代替方法があります。我々は以前にマイクロインジェクションはそのまま20,21腺の上皮細胞へのアデノウイルスを導入するために用いることができることを報告した。しかし、マイクロインジェクションはCONTRすることは困難であるオール、物理的に腺を損傷する恐れがあり、通常はセル20のみローカライズサブセットの感染につながる。アデノ随伴ウイルス（AAV）は無傷SMG器官外植片22のコンテキスト内での異なる細胞集団のトランスフェクションのために有用であることが示されている。血清型scAAV2は他の組換えAAVベクター23以上無傷サブマシンガンの上皮の特定の形質導入で実質的に、より効率的であることが示された。のAAVは、広く市販されていない、また専門知識がほとんどの研究室に存在するAAVを準備するために行うので、ここで提供されるアデノウイルス形質導入と組織の組換えプロトコルは、AAVベクターの使用がそうであるより、ほとんどの実験室に、より一般的にアクセス可能です。
ある程度この組織組換え法の再現する、上皮 - 間葉相互作用が、それはアデノウイルスで上皮に感染し、そのネイティブの文脈の外上皮を成長させることも可能です。前述したように、我々は、アデノウイルスをそのまま唾液上皮初歩を感染させ、外から加えられた成長因子17,20,21とマトリゲルの文化となりました。これらの足場は、彼らの現在のフォーム15の間葉の完全な機能を再現しませんが、唾液腺器官外植片はまた、ナノファイバー足場上で培養することができます。ネイティブ間葉これらのメソッドのどちらも再現する一方で、そのような方法は、ex vivoで培養中の間葉の特定の特性の模倣を可能にします。
各ex vivoでの培養方法には独自の長所と短所を持っていますが、具体的な科学的問題に対処するために適当である。組換え腺はそのまま唾液腺器官外植片、器官外植片がそうであるように多くの分枝形態形成として受けるわけではありませんが、一般的には、わずか数日間分枝形態形成、生体内で繰り返す。この問題を解決するには、CREにはもちろんである上皮区画内で標的遺伝子の発現を含むトランスジェニック動物を食べました。初期のSMGは上皮の開発に特異的に活性化し、遺伝子組換え技術が記載されている方法よりもかなり高価ままされる既知のプロモーターの不足があるので、ここで説明された組織の組換え実験は内シグナリングの両方上皮細胞と間葉細胞を研究するために実行可能なモデルシステムを構成初期の彼らの組織のコンテキスト内で唾液腺細胞を開発する。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
著者らは、有益なコメントや原稿の批判的な読みのための博士ディアドラネルソンに感謝したいと思います。この作品は、アルバニー大学、ニューヨーク州立大学にNIHの助成DE019244、DE019197、DE021841とMLに、F32DE02098001 SJSへ、そしてC06 RR015464によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 Medium without phenol red | Life Technologies | 21041-025 | |
| Penicillin and Streptomycin | Life Technologies | 15070-163 | 10X stock |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | Freeze single use aliquots at -20C |
| BSA | Sigma | A2934-100G | Fraction V, low endotoxin |
| Adeno-X-GFP | BD Biosciences | 8138-1 | Should be high titer (1x1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay. |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v) |
| 1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 70011-044 | Prepared from 10X stock |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14175095 | no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red |
| Transferrin | Sigma | T8158 | 25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | Sigma | A4403 | 75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C |
| Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol. | |||
| 10 cm sterile plastic dishes | Corning | 430167 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo dissecting microscope with transmitted light base | Nikon | SMZ645 | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| 35 mm tissue culture dishes | Falcon | 353001 | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm diameter microwell dishes | MatTek Corporation | P50-G-1.5-14F | |
| Nuclepore Track-Etch membrane filters | Whatman | 110405 | 13 mm diameter, 0.1 mm pore size |
| Widefield fluorescence microscope | Carl Zeiss, USA | Axio Observer Z1 | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Scalpel blade #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm | Fine Science Tools | 11252-20 | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm | Fine Science Tools | 11295-20 | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol. | |||
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